甲減性心力衰竭大鼠心肌纖維化及其分子機(jī)制研究.pdf

1、甲狀腺功能減退（簡(jiǎn)稱甲減）是一種常見(jiàn)的甲狀腺疾病，我國(guó)學(xué)者報(bào)道的臨床甲減患病率為1.0％。心血管系統(tǒng)是甲狀腺激素最重要的作用靶點(diǎn)之一，近年來(lái)，甲狀腺激素與心力衰竭（簡(jiǎn)稱心衰）的關(guān)系已經(jīng)引起人們關(guān)注。心衰是發(fā)病率最高的心血管疾病，治療心衰是當(dāng)前心血管疾病研究的熱點(diǎn)。心衰的病理基礎(chǔ)之一是早期的心肌纖維化，纖維化是心臟長(zhǎng)期負(fù)荷過(guò)重時(shí)發(fā)生的一種心室重構(gòu)，是多種心血管系統(tǒng)疾病的常見(jiàn)并發(fā)癥和病理基礎(chǔ)，常導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常、心力衰竭，因此預(yù)防與逆轉(zhuǎn)這

2、種改變就成為了治療心衰研究的重要方向。研究表明，甲減與心衰關(guān)系密切，但甲減導(dǎo)致心衰的相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明。此外，動(dòng)物模型是研究甲減與心衰關(guān)系的主要途徑，但目前國(guó)內(nèi)外尚未建立方便穩(wěn)定的甲減致心衰的動(dòng)物模型。在心肌纖維化的相關(guān)研究中人們發(fā)現(xiàn)，磷酸腺苷(AMP)基因突變可導(dǎo)致心肌肥大及心律失常，AMPK的激活可通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)mTOR/p70S6K通路減輕由壓力負(fù)荷過(guò)度誘發(fā)的的心肌纖維化。因此AMPK有望成為心肌纖維化疾病中的治療新靶點(diǎn)。

3、　　本課題擬建立腹腔注射131I致甲減性心力衰竭大鼠模型，研究甲減導(dǎo)致心力衰竭大鼠心肌纖維化作用的靶點(diǎn)及相關(guān)分子機(jī)制。本研究結(jié)果將有助于闡明甲減導(dǎo)致心衰的可能機(jī)制，為甲減患者心衰的防治提供新思路和研究途徑。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下兩部分:
　　第一部分甲減性心力衰竭大鼠動(dòng)物模型的建立
　　目的:建立通過(guò)腹腔注射131I致甲減性心力衰竭大鼠模型。
　　方法:清潔級(jí)雄性健康Wistar大鼠（體重在200-220g）56只，適

4、應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為7組:正常對(duì)照組、100μCi組、300μCi組、500μCi組、700μCi組、900μCi組、1100μCi組，每組8只。將131I用生理鹽水稀釋制成混合液，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別腹腔注射含100μCi、300μCi、500μCi、700μCi、900μCi、1100μCi131I的等體積混合液，正常對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。喂養(yǎng)4周及8周后，心臟超聲評(píng)價(jià)大鼠心臟功能，核素掃描了解大鼠甲狀腺聚碘功能，ELISA試劑盒

5、測(cè)定血清TT3、TT4、TSH、BNP水平，綜合判斷造模是否成功。
　　結(jié)果:
　　1、實(shí)驗(yàn)8周末，甲狀腺核素掃描處理組各組大鼠攝碘功能與正常對(duì)照組相比較顯著下降。
　　2、大鼠甲狀腺功能
　　實(shí)驗(yàn)4周末及實(shí)驗(yàn)8周末，處理組各組大鼠TT3、TT4水平與正常對(duì)照組相比降低（P＜0.05），處理組各組TSH水平與正常對(duì)照組相比明顯升高(P＜0.05），隨著131I劑量增加差異更加顯著，但700μCi以上組與300μC

6、i組、500μCi組相比未見(jiàn)明顯差異。
　　3、大鼠心臟功能
　　實(shí)驗(yàn)4周末，處理組各組大鼠室間隔厚度與正常對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.05），700μCi以上組舒張期左室內(nèi)徑與正常對(duì)照組、100μCi組、300μCi組、500μCi組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），300μCi以上組左室后壁厚度、射血分?jǐn)?shù)與正常對(duì)照組及100μCi組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，500μCi以上組收縮期左室內(nèi)徑與100μCi組

7、、300μCi組及正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），處理組各組左室內(nèi)徑縮短率與正常對(duì)照組相比明顯降低（P＜0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)8周末，處理組各組大鼠室間隔厚度、左室后壁厚度與正常對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05），300μCi以上組舒張期左室內(nèi)徑、收縮期左室內(nèi)徑、射血分?jǐn)?shù)、左室內(nèi)徑縮短率與正常對(duì)照組、100μCi組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著131I劑量增加差異更加顯著，但700μCi以上組與300μ

8、Ci組、500μCi組相比未見(jiàn)明顯差異。
　　4、大鼠BNP表達(dá)水平
　　實(shí)驗(yàn)4周末，處理組各組大鼠BNP水平與正常對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)8周末，處理組各組大鼠BNP水平與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05），并且隨著131I劑量增加差異更加顯著。
　　結(jié)論:
　　131I腹腔注射可致大鼠甲狀腺功能減低，同時(shí)伴有心功能下降。300μCi、500μCi131I劑量為最佳模型劑量

9、。
　　第二部分甲減性心力衰竭大鼠心肌纖維化相關(guān)分子機(jī)制研究
　　目的:觀察甲減大鼠心肌形態(tài)學(xué)變化并對(duì)纖維化進(jìn)行評(píng)估，通過(guò)對(duì)AMPK及mTOR/p70S6K通路進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)甲減對(duì)甲減性心力衰竭大鼠心肌纖維化作用的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:選取第一部分100μCi組、300μCi組、500μCi組及正常對(duì)照組四組大鼠的部分心尖組織切片行HE染色及天狼星紅染色，HE染色觀察心臟大體組織及細(xì)胞橫切面積，天狼星紅染色觀察心肌

10、組織膠原含量。RT-PCR方法測(cè)定心臟組織NF-κB、CollagenⅠ、TGF-β、TNF-α、mTOR、EEF2、AMPK、p70S6K基因表達(dá)水平。Western-Blot方法測(cè)定心臟AMPK、P-AMPKα2Ser491、EEF2、P-EEF2、 p70S6K、P-p70S6K Ser424、mTOR、P-mTOR蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、病理學(xué)結(jié)果
　　(1) HE染色結(jié)果
　　處理組各組與正

11、常對(duì)照組相比，心肌細(xì)胞排列順序紊亂，細(xì)胞和細(xì)胞核大體形態(tài)不規(guī)則，心肌細(xì)胞所占面積顯著增大。
　　(2)天狼星紅染色結(jié)果
　　處理組各組與正常對(duì)照組相比，心肌細(xì)胞膠原含量顯著增多，細(xì)胞內(nèi)膠原纖維增粗增大，排列順序紊亂，血管周圍的膠原增生明顯。
　　2、8周末大鼠心肌組織基因表達(dá)水平
　　8周末處理組各組大鼠心肌組織mTOR、EEF2、AMPKα2、p70S6K基因表達(dá)與正常對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05

12、);處理組各組NFκB、TNF-α基因表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);300μCi組、500μCi組CollagenⅠ、TGF-β基因表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、8周末大鼠心肌組織通路蛋白表達(dá)
　　8周末處理組各組大鼠心肌組織mTOR、EEF2、AMPKα2、p70S6K蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);處理組各組P-mT

13、OR、P-AMPKα2Ser491、P-p70S6K Ser424蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);處理組各組P-EEF2蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、在甲減性心力衰竭大鼠模型中，NFκ、CollagenⅠ、TGF-β、TNF-α基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，HE染色及天狼星紅染色結(jié)果均表明在甲減性心力衰竭大鼠中心肌纖維化形成。<