珍珠膜海綿共附生微生物PKS與NRPS的篩選與模塊結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、本論文從開發(fā)海洋藥物及探詢藥源問題出發(fā)，針對(duì)我國(guó)沿海特殊來源的微生物——海洋生物附生細(xì)菌開展了一系列的探索性研究。我們通過抗菌、細(xì)胞毒的篩選，從分離到的364株海洋細(xì)菌中獲得42株具有抗菌活性的海洋細(xì)菌，12株具有細(xì)胞毒活性的海洋細(xì)菌。對(duì)12株具有細(xì)胞毒活性的細(xì)菌菌株進(jìn)行了16SrRNA系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析，它們分別屬于Agrobacterium，Pseudoalteromons，Bacillus，Paracoccus,Rheinheimer

2、a,Aerococcus,Exiguobacterium和Alteromonas8個(gè)屬。同時(shí)，對(duì)這12株具有細(xì)胞毒活性的細(xì)菌菌株進(jìn)行進(jìn)一步的多聚酮合酶(PKS Ⅰ型)和非核糖體肽合成酶(NRPS)的篩選，得到了4株含有PKS Ⅰ型的KS結(jié)構(gòu)域或NPRS的A結(jié)構(gòu)域的海洋細(xì)菌，為從聚酮和非核糖體肽等生物合成途徑去深入研究其次生代謝產(chǎn)物提供了基因?qū)W的證據(jù)。
　　 以海洋微生物Pseudoalteromons sp.NJ632作為研究對(duì)

3、象，運(yùn)用Genome-walking策略對(duì)已獲得KS片段的上、下游區(qū)域進(jìn)行了部分的步移得到了一段約為10 Kb大小的連續(xù)的核苷酸序列，對(duì)其中疑似PKS的開放閱讀框(ORF)進(jìn)行了PKS模件中結(jié)構(gòu)域的分析。結(jié)果顯示，我們獲得了包括ketosynthase(KS)，acyltransferase(AT)，dehydratase(DH)， ketoreductase(KR)， cyclization(Cy)在內(nèi)的一個(gè)相對(duì)完整的PKS模件。在我

4、們獲得的PKS模件的結(jié)構(gòu)中，除了常見的PKS相關(guān)結(jié)構(gòu)域外，還發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)域cyclization(Cy)，這在以往的報(bào)道中極少見到。這也暗示在NJ6-3-2中有可能存在一個(gè)PKS/NRPS雜合的，且結(jié)構(gòu)非常特殊的雜合基因簇。
　　 以海洋微生物Pseudoalteromons sp.NJ631作為研究對(duì)象，首次成功的構(gòu)建并保存了其基因組文庫，并對(duì)文庫質(zhì)量做了相應(yīng)的鑒定，保證了文庫的完整性。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用來自于其本身的酮基合酶

5、基因(KS)制備探針，對(duì)2880個(gè)單克隆進(jìn)行了雜交篩選，獲得了14個(gè)陽性克隆子，分別標(biāo)記為：AE1，BG2，CA1，CB6，DD12，DH5，F(xiàn)A11，GC10，GD7，GG4，KG10，LD8，MH9，OA5。運(yùn)用“染色體步移”策略，對(duì)這14個(gè)陽性重組子上所插入的NJ6-3-1的基因組DNA片段進(jìn)行簡(jiǎn)單的排序，并結(jié)合相應(yīng)的酶切片段，最終確定，陽性克隆子BG2，GG4最有可能是14個(gè)陽性克隆子最外側(cè)的兩個(gè)克隆子，采用鳥槍法(Shot G

6、un Sequencing)對(duì)陽性克隆子BG2，GG4進(jìn)行了大片段測(cè)序，獲得了一條約為60 Kb的，連續(xù)的DNA序列。通過生物信息學(xué)分析，對(duì)其中所包含的20個(gè)開放閱讀框(ORF)進(jìn)行了逐一的功能注釋。對(duì)疑似PKS或NRPS的三個(gè)ORF(ORF14，ORF15和ORF19)運(yùn)用在線軟件“NPRS-PKS"對(duì)其PKS或NRPS的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了預(yù)測(cè)。最終，獲得了一個(gè)包括終止結(jié)構(gòu)域“TE”在內(nèi)的，由7個(gè)連續(xù)模件組成的，完整的，NRPS/PKS雜合

7、生物合成基因簇，命名為“NJ631 NPRS-PKS生物合成基因簇”。運(yùn)用NRPS A結(jié)構(gòu)域底物特異性預(yù)測(cè)法則，我們成功的對(duì)獲得的NJ631NRPS/PKS雜合生物合成基因簇中4個(gè)A結(jié)構(gòu)域(A2，A3，A4，A5)進(jìn)行了其各自的特異性底物的預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，4個(gè)A結(jié)構(gòu)域(A2，A3，A4，A5)各自特異性結(jié)合的氨基酸為：Glu/Gln，Ser，Ser-D，Aeo。
　　 為了制備Pseudoalteromons sp.NJ63 l

8、的NRPS-PKS基因簇中KS結(jié)構(gòu)域的特異性抗體，同時(shí)也進(jìn)行A結(jié)構(gòu)域的底物特異性酶活檢測(cè)，我們采用已商品化的pET表達(dá)系統(tǒng)(pET-28a)構(gòu)建了分別含有KS、A1、A2、A3、A4、A5結(jié)構(gòu)域的表達(dá)質(zhì)粒pZPKS2、pZPA12、pZPA22、 pZPA32、pZPA42、pZPA52。異源表達(dá)結(jié)果顯示，我們成功的在大腸桿菌BL21(DE3)中超量表達(dá)了KS、A1、A3和A4結(jié)構(gòu)域，為今后的KS結(jié)構(gòu)域的特異性抗體制備和A結(jié)構(gòu)域的底物特

9、異性酶活檢測(cè)提供了必要條件。
　　 本論文從海洋生物附生微生物的分離開始，進(jìn)行了其代謝產(chǎn)物生物活性(抗菌、細(xì)胞毒)和功能基因(PKS、NRPS)篩選以及活性菌株的分子鑒定：運(yùn)用Genome-walking策略對(duì)分離得到的活性菌Pseudoalteromons sp.NJ632中的PKS模件進(jìn)行了初步的研究，同時(shí)，通過文庫構(gòu)建、篩選、測(cè)序，采用反向遺傳學(xué)的手段初步揭示了活性菌Pseudoalteromons sp.NJ631中存在

10、一個(gè)NRPS/PKS雜合的生物合成途徑，并對(duì)合成途徑中的A結(jié)構(gòu)域的底物特異性進(jìn)行了預(yù)測(cè)；最后，對(duì)獲得的“NJ631 NRPS-PKS生物合成途徑”中的核心結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了異源表達(dá)的嘗試。這項(xiàng)工作不僅完善了一套進(jìn)行海洋微生物活性天然產(chǎn)物研究的系統(tǒng)方法，為開發(fā)具有藥用潛力的天然化合物建立模型，也為海洋微生物作為海洋活性物質(zhì)的藥源提供新的依據(jù)。本工作在海洋微生物活性天然產(chǎn)物的研究中盡管尚處于初級(jí)階段，但在整個(gè)課題的研究中取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，對(duì)后續(xù)研