具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的海綿共附生微生物及其活性產(chǎn)物研究.pdf

1、海綿共附生微生物是尋找和開發(fā)天然活性產(chǎn)物的重要來源之一，是研制糖尿病新型藥物（α-葡萄糖苷酶抑制劑）的有效途徑。
　　 本研究通過建立α-葡萄糖苷酶活性抑制劑篩選模型，對美國圣璜島海域海綿的附生微生物發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行活性篩選。其中，α-葡萄糖苷酶活性測試體系是在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，在α-葡萄糖苷酶濃度為0.008U/mL，pH值為6.8，反應(yīng)溫度37℃，測定產(chǎn)物波長為405nm的基礎(chǔ)上，優(yōu)化篩選模型。結(jié)果表明，模型的最佳篩選條件:底

2、物PNPG濃度為10mmol/L、活性測試反應(yīng)時(shí)間為25min，以及樣品溶劑DMSO含量為2％ V/V。
　　 以α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖作為陽性對照樣品，利用上述優(yōu)化后的抑制活性篩選模型，對212株海綿微生物的粗提物樣品進(jìn)行篩選。結(jié)果表明:19株微生物的粗提物抑制率大于50％;其中，對于抑制活性最高的5株菌的粗提物，在濃度為0.4、0.6或0.8 mg/mL時(shí)，其抑制活性均在70％以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于阿卡波糖的最高抑制率58％(

3、1.6mg/mL)。其中菌株HY936粗提物濃度在0.4mg/mL時(shí)，仍具有很高的α-葡萄糖苷酶抑制率79.3％。并對菌株HY936進(jìn)行16S rDNA測序及分析，鑒定該菌株為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（Bacillus firmus）。
　　 本研究還對活性菌株Bacillus firmus的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以培養(yǎng)時(shí)間，搖床轉(zhuǎn)速，接種量作為分析因素;正交試驗(yàn)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)，以蛋白胨、酵母膏、NaCl和pH值作為

4、分析因素;從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中確定適合菌株Bacillus firmus生長的最佳條件。然后，對菌株進(jìn)行批量發(fā)酵，收集到粗提物2.8g，將其代謝產(chǎn)物通過硅膠薄層層析，高效分析液相等方法分離純化。其中，硅膠柱粗分得到的組分Fr.1和Fr.4具有很高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制率分別為35.5％、19.6％。對組分Fr.1作進(jìn)一步的分離純化，得到的組分Ⅱ?qū)Ζ?葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)82.38％。通過GC-MS鑒定出組分Ⅱ中的11種化合物，主要成分是