光學(xué)分子成像技術(shù)用于細(xì)胞治療與示蹤的研究.pdf

1、細(xì)胞治療以及器官移植作為可以修復(fù)或者代替受損器官的治療手段正在臨床中受到越來越多的重視和應(yīng)用。但是對于細(xì)胞移植體內(nèi)后的存活、增殖、分化等行為的監(jiān)控技術(shù)卻極為有限。當(dāng)前，主要的分析方法是組織切片和免疫組化染色，然而如何在活體水平上動態(tài)的觀察植入細(xì)胞的存活、增殖和分化等狀態(tài)仍然是一項(xiàng)亟待解決的重要課題。分子影像技術(shù)是近年來發(fā)展的一種化學(xué)、分子生物學(xué)、放射醫(yī)學(xué)以及計(jì)算機(jī)科學(xué)相結(jié)合的新興交叉學(xué)科，其具有活體、非創(chuàng)傷、實(shí)時(shí)的在細(xì)胞和分子水平上觀察

2、組織細(xì)胞行為的特點(diǎn)。當(dāng)前，分子影像技術(shù)主要分為：放射性同位素成像、磁共振成像、生物發(fā)光成像以及熒光發(fā)光成像四種技術(shù)，它們在實(shí)際的應(yīng)用過程中都有其各自的特點(diǎn)。其中，生物發(fā)光成像和熒光發(fā)光成像統(tǒng)稱為光學(xué)成像。由于其具有信號靈敏、檢測方便以及易于修飾等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為生物學(xué)，醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本論文所介紹的三項(xiàng)研究工作均是圍繞光學(xué)成像在細(xì)胞活體示蹤方面的應(yīng)用來開展的。
　　本論文第一部分應(yīng)用β-Actin-luc和Vegfr2-luc兩

3、種生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因動物并提取它們的胰島組織，鋪種到具有緩慢釋放肝素功能的絲素三維多孔支架中，隨后移植到一型糖尿病小鼠體內(nèi)，以期恢復(fù)正常的血糖水平并改善動物的生存狀況。通過血糖監(jiān)控及組織學(xué)評價(jià)，我們證明負(fù)載肝素的多孔支架在體內(nèi)可以明顯提高胰島在體內(nèi)的存活以及功能。同時(shí)，我們利用生物發(fā)光活體成像技術(shù)進(jìn)一步評價(jià)材料在體內(nèi)發(fā)揮功能的機(jī)制。通過胰島的成像信號我們發(fā)現(xiàn)，絲素支架可以在體內(nèi)可以很好的保護(hù)胰島的存活，支架所釋放的肝素促進(jìn)了胰島以及移植位點(diǎn)

4、的血管新生水平，同時(shí)體外血糖水平以及組織學(xué)檢測也證明了活體成像信號所反映的生物過程，這些結(jié)果都預(yù)示了生物發(fā)光成像技術(shù)在胰島移植以及組織工程材料體內(nèi)活性的評價(jià)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　雖然生物發(fā)光技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn)，但也有很多諸如細(xì)胞標(biāo)記方法復(fù)雜和生物安全性未知等缺點(diǎn)。熒光成像（fluorescence imaging）具有成像信號強(qiáng)，易于標(biāo)記，不受成像深度局限等特點(diǎn)，可以為細(xì)胞活體示蹤提供另一種具有應(yīng)用前景的光學(xué)成像示蹤方法。目前

5、，傳統(tǒng)的熒光成像所應(yīng)用的發(fā)光染料都存在著很多缺點(diǎn)以及問題。首先，在實(shí)際應(yīng)用中，為了增強(qiáng)熒光信號通常會使染料聚集，但傳統(tǒng)的染料的熒光會隨著這個(gè)過程產(chǎn)生淬滅現(xiàn)象；其次，這些染料在激發(fā)光持續(xù)激發(fā)下發(fā)射的熒光會變得不穩(wěn)定并發(fā)生淬滅；另外，量子點(diǎn)等無機(jī)熒光材料對細(xì)胞毒性較大，且細(xì)胞駐留能力弱，容易隨著細(xì)胞分裂而造成信號丟失。這些缺點(diǎn)都限制了其在體內(nèi)示蹤細(xì)胞治療中的應(yīng)用。
　　具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）特性的有機(jī)熒光染料近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐

6、漸受到越來越多的重視，它具有不同于傳統(tǒng)染料的優(yōu)越的光學(xué)性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)首先基于AIE原理設(shè)計(jì)出一種新穎、高亮度的熒光納米粒子。我們通過體外實(shí)驗(yàn)證明，這種納米粒子具有優(yōu)異的體外細(xì)胞示蹤性能和較低的細(xì)胞毒性。之后，標(biāo)記的細(xì)胞被注射到小鼠下肢缺血的損傷組織中，通過活體成像技術(shù)追蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的存活以及治療效果，并通過體內(nèi)體外一系列實(shí)驗(yàn)來檢測納米粒子在體內(nèi)生物安全性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明這種新型熒光納米粒子可以在體內(nèi)精確、長期示蹤干細(xì)胞達(dá)1.5個(gè)月左右，就

7、我們所知是同類細(xì)胞示蹤產(chǎn)品中示蹤能力最高的，它們會為今后的干細(xì)胞體內(nèi)移植提供一種非常具有應(yīng)用前景的追蹤方法。
　　共軛高分子（CPs）是一種擁有高自由度π共軛骨架的熒光高分子，它是新一代的有機(jī)熒光納米材料，具有良好的光穩(wěn)定性，亮度高，細(xì)胞毒性低。基于這些特性，CPs有希望成為另一種新型的細(xì)胞體內(nèi)示蹤染料。在論文第四章中，我們對于CPs染料在追蹤MSCs治療方面進(jìn)行研究。首先將CPs用DSPE-PEG包裹后表面連接穿膜肽（Tat-p

8、eptide）以利于細(xì)胞滲透。然后，通過全層皮膚損傷的小鼠模型，探究了移植干細(xì)胞在組織愈合方面的治療作用。研究表明，CPs納米粒子在體內(nèi)表現(xiàn)出了良好的細(xì)胞示蹤能力。納米粒子在細(xì)胞內(nèi)化過程中不破壞MSCs的增殖、遷移、分化和分泌方面的特性，并且可以長期體內(nèi)示蹤干細(xì)胞達(dá)21天左右。實(shí)驗(yàn)表明，相比于商品化的量子點(diǎn)等示蹤產(chǎn)品，CPs納米粒子有著優(yōu)越的干細(xì)胞示蹤能力。它們可以作為一種新穎的外源性細(xì)胞示蹤探針，在認(rèn)識干細(xì)胞治療的機(jī)制和探索細(xì)胞體內(nèi)行