構(gòu)建在活體小動物示蹤細胞周期G1期的光學(xué)分子報告基因.pdf

1、背景與目的:人類很多疾病特別是惡性腫瘤都與細胞周期的非正常激活有關(guān)。很多抗腫瘤藥物的作用靶點是控制細胞周期的關(guān)鍵酶,通過抑制酶的活性,阻礙腫瘤細胞的增殖并誘導(dǎo)細胞程序性凋亡。細胞周期指由細胞分裂結(jié)束到下一次細胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程,包含G1期、S期、G2期、M期。CyclinE在G1期表達,S期降解,通過激活CDK2促進細胞周期進入S期,G1/S過渡期是最重要的細胞周期檢查點,決定細胞開始第一輪增殖、分化、死亡或者退出細胞周期進入G0期

2、。光學(xué)分子影像技術(shù)是應(yīng)用光學(xué)成像在分子或細胞水平上研究活體狀態(tài)下的生理,本研究旨在構(gòu)建反映細胞周期G1期融合報告基因,實現(xiàn)利用生物發(fā)光成像技術(shù)無創(chuàng)地在活體檢測細胞周期的變化。
　　材料和方法:利用cyclinE細胞周期依賴性變化和泛素化依賴性降解的特性,利用熒光素酶基因能夠應(yīng)用于活體動物這一特點,以融合蛋白技術(shù)構(gòu)建CyclinE-luc基因真核表達重組載體,通過共轉(zhuǎn)染方法建立穩(wěn)定表達CyclinE-luc的腫瘤細胞株。采用細胞周期

3、同步化法檢測CyclinE-luc的表達是否依細胞周期而調(diào)節(jié);采用siRNA干擾及蛋白酶體抑制實驗來驗證CyclinE-luc的泛素化依賴性降解途徑;采用載體成像的方法來檢測CyclinE-luc是否可以在體監(jiān)測細胞周期的變化;采用免疫組化的方法來驗證細胞是否受抗腫瘤藥物影響。
　　結(jié)果:CyclinE-luc的表達水平隨細胞周期變化而變化,在G1期達到最高點。CyclinE-luc在敲出Fbw7及抑制蛋白酶體后積累明顯增加。Cy