構(gòu)建細(xì)胞周期G1期和S期特異性光學(xué)分子報告基因以及監(jiān)測抗腫瘤藥物阻滯細(xì)胞周期的應(yīng)用.pdf

1、背景與目的：細(xì)胞周期是指以有絲分裂方式進(jìn)行增殖的細(xì)胞從一次分裂完成時開始到下一次分裂完成時為止所經(jīng)歷的全過程。通常由G1期、S期、G2期和M期組成。細(xì)胞在G1期完成必要的生長和物質(zhì)準(zhǔn)備，在S期完成染色體DNA的復(fù)制。當(dāng)前研究表明，細(xì)胞周期紊亂是人類惡性腫瘤的共同特征，而臨床上使用的許多抗腫瘤藥物，其作用靶點也是針對控制細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白。cyclin E在 G1期表達(dá)，S期降解，通過激活 CDK2促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入 S期，Skp2的表達(dá)水

2、平在G0/G1期非常低,而在S期表達(dá)增加。光學(xué)分子影像技術(shù)是應(yīng)用光學(xué)成像在分子或細(xì)胞水平上研究活體狀態(tài)下的生理，光學(xué)成像的報告基因分子如螢火蟲（Firefly）熒光素酶，已經(jīng)成為一個受歡迎的跟蹤和可視化活體動物的方法,本研究的目的在于構(gòu)建細(xì)胞周期G1期和S期特異性光學(xué)分子報告基因，通過分子影像學(xué)及生物發(fā)光成像技術(shù)，監(jiān)測抗腫瘤藥物對細(xì)胞周期的阻滯，為在體、實時、無創(chuàng)的檢測細(xì)胞周期的改變提供較好的模型。
　　材料與方法：cyclin

3、E蛋白和Skp2蛋白的表達(dá)具有依賴細(xì)胞周期變化而波動的特性，我們利用熒光素酶基因可以應(yīng)用于活體進(jìn)行成像的特點，應(yīng)用融合蛋白構(gòu)建技術(shù)構(gòu)建cyclin E-luc2和Skp2-luc2基因真核表達(dá)載體，通過篩選建立穩(wěn)定表達(dá)兩個融合蛋白的Hela腫瘤細(xì)胞株，并挑取熒光素酶活性較高的單克隆。使用動物活體成像的技術(shù)檢測cyclin E-luc2和 Skp2-luc2是否可以在體監(jiān)測細(xì)胞周期的變化；采用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測藥物刺激2株單克隆細(xì)胞株后

4、，細(xì)胞周期的變化與成像系統(tǒng)所監(jiān)測到的熒光素酶活性的變化是否一致。
　　結(jié)果：cyclin E-luc2和Skp2-luc2的表達(dá)水平均隨細(xì)胞周期變化而變化，分別在 G1期和S期達(dá)到最高點。流式細(xì)胞檢測兩穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株在PD0332991抗腫瘤藥處理后結(jié)果顯示G1期細(xì)胞阻滯增多。此時，cyclin E-luc2單克隆細(xì)胞株熒光素酶活性于24h時明顯上升約4倍。Skp2-luc2單克隆細(xì)胞株熒光素酶活性上升約4倍。
　　結(jié)論：成功構(gòu)