高血氨誘導(dǎo)肝細胞損傷及其代謝組學(xué)的研究.pdf

1、肝衰竭是常見的危重癥，死亡率高達70~80％。肝衰竭的發(fā)病機制尚不清楚，其治療仍是世界性難題。在肝衰竭中，存在大量肝細胞壞死，肝功能受損，肝細胞再生和分化障礙，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一。殘存的肝細胞無法滿足機體的需要，導(dǎo)致肝細胞的轉(zhuǎn)化和代謝功能紊亂，引發(fā)如血氨、乳酸、間接膽紅素等代謝產(chǎn)物蓄積。目前“二次損傷”學(xué)說是肝衰竭發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，肝衰竭最常見的代謝紊亂---高血氨，其神經(jīng)毒性已經(jīng)被眾多學(xué)者研究，但是它是否會造成肝臟的二

2、次損傷未見相關(guān)報道。
　　我們以高血氨為研究肝衰竭的切入點，前期首次建立高血氨攻擊大鼠模型，證實高血氨可以誘導(dǎo)大鼠肝臟的“二次損傷”，但是尚未在細胞水平研究高血氨對人肝細胞的損傷作用及其機制。肝臟是人體非常重要的代謝器官，當(dāng)肝臟出現(xiàn)病理改變，必然伴隨與之相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)的變化。因此研究高血氨對肝細胞損傷機制，不能僅著眼于肝細胞本身的損傷，還需要用整體性思維即系統(tǒng)生物學(xué)來研究。高血氨誘導(dǎo)肝損傷的代謝組學(xué)研究在國際上鮮有報道。于是研究高血

3、氨誘導(dǎo)肝細胞損傷及其代謝組學(xué)，為揭示高血氨在肝衰竭中的分子生物學(xué)機制提供理論基礎(chǔ)，并為肝衰竭的預(yù)防和治療提供新的干預(yù)策略和作用靶點。
　　方法:
　　1氨對肝細胞特異性損傷作用
　　首先構(gòu)建高血氨細胞模型，采用 CCK-8法和流式細胞儀檢測氨對不同細胞系增殖和凋亡的影響，探討氨對肝臟細胞的損傷和凋亡作用是否具有特異性。采用 Real-time PCR和 Western Bloting檢測氨轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白:Rh C型糖蛋白

4、（Rh family, C glycoprotein，RHCG）和水通道蛋白8（aquaporin-8，AQP8）的表達，探討其特異性機制。采用電子顯微鏡和活體細胞線粒體膜通道孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore，mPTP）熒光檢測，觀察細胞線粒體形態(tài)并檢測線粒體膜通透性，以探討其可能的損傷機制。
　　2氨對肝細胞代謝譜的影響
　　建立以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ gas chr

5、omatography-mass spectrometry， GC-MS）技術(shù)為基礎(chǔ)的高血氨細胞模型代謝組學(xué)方法，了解高血氨對肝細胞代謝譜的影響，結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析和比對數(shù)據(jù)庫等方法，篩選并鑒定出差異代謝產(chǎn)物，找出差異代謝通路。根據(jù)GC-MS結(jié)果提供的相關(guān)線索，結(jié)合Real-time PCR、Western Bloting等技術(shù)對差異代謝通路進行驗證和深入研究。
　　結(jié)果:
　　1氨對肝細胞具有特異性損傷作用
　　1.1

6、氨對肝細胞增殖和形態(tài)的影響以及建模濃度的選擇
　　隨著氨濃度增加和（或）處理時間的延長，原代肝細胞的生長增殖受到明顯的抑制，顯微鏡下，肝細胞生長密度也隨之顯著下降并最終出現(xiàn)空泡現(xiàn)象。10 mM的氨濃度是理想的建模濃度。
　　1.2氨對肝類細胞和非肝類細胞增殖和凋亡的影響
　?。?）氨抑制肝類細胞的生長和增殖，尤其是原代肝細胞；對非肝類細胞生長影響不大。
　?。?）氨能明顯誘導(dǎo)原代肝細胞凋亡，而對其它類型的細胞凋亡

7、影響不大
　　1.3氨對不同細胞系氨轉(zhuǎn)運蛋白的影響
　　氨能明顯影響原代肝細胞氨轉(zhuǎn)運體RHCG、AQP8 mRNA和蛋白的表達,其它細胞系氨轉(zhuǎn)運體的表達不受氨的影響。
　　1.4氨對肝功能酶學(xué)指標(biāo)的影響
　　與對照組相比，高氨細胞模型中谷胱甘肽（glutathione，GSH）呈現(xiàn)先降低然后又恢復(fù)正常的趨勢，谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）呈現(xiàn)先明顯上升后又顯著下降的趨勢，

8、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ Aspartate transaminase，AST）在最初的48小時之前無明顯差異，之后呈現(xiàn)明顯升高的趨勢。環(huán)氧化物水解酶（cyclo-oxygen-ase，COX）在24小時之后呈現(xiàn)明顯升高的趨勢。
　　1.5氨對肝細胞線粒體損傷和凋亡的影響
　　電鏡下高氨環(huán)境的肝細胞線粒體出現(xiàn)腫脹、變圓、嵴紊亂和空泡化等形態(tài)變化，氨誘導(dǎo)mPTP,增加線粒體通透性。與此同時發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。
　　2氨對

9、肝細胞代謝譜的影響
　　1）建立 GC-MS檢測高氨肝細胞模型代謝譜的方法，通過多元統(tǒng)計分析方法，發(fā)現(xiàn)氨處理組與未處理組代謝存在顯著差異。
　　2）GC-MS檢測到648個代謝產(chǎn)物，找到120個差異代謝產(chǎn)物，并根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)庫鑒定代謝產(chǎn)物，找出主要差異代謝通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨處理組三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)和嘌呤嘧啶通路等均出現(xiàn)代謝障礙。
　?。?）氨對三羧酸循環(huán)的影響
　　氨處理組的三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物如檸檬酸、α-酮戊二酸

10、、蘋果酸水平都顯著降低，并檢測到ATP生成減少。
　?。?）氨對尿素循環(huán)的影響
　　高氨環(huán)境下尿素水平并沒有升高，而是與未處理組相比無明顯差異。精氨酸水平明顯降低，鳥氨酸水平輕度升高。并且檢測到尿素循環(huán)關(guān)鍵的限速酶同時也是代謝氨的關(guān)鍵酶 CPS-I明顯受到氨的抑制。而參與氨代謝的另一個重要酶——氨甲酰磷酸合成酶II(carbamoylphosphate synthetaseII, CPS-II)，即CPS-I的同工酶，其的表

11、達增強。即高氨環(huán)境下CPS-I表達減弱，而CPS-II表達增強
　　（3）氨對嘌呤嘧啶代謝的影響
　　在氨處理組中，嘌呤通路代謝產(chǎn)物肌苷、黃嘌呤水平較對照組明顯減少；嘧啶通路中乳清酸、尿嘧啶、β-丙氨酸、胞嘧啶、異丁二酸水平與對照組相比也明顯減少，而胸苷酸是增多的。乳清酸是核酸合成的重要前體物質(zhì)，結(jié)合Real-time PCR和Western Bloting技術(shù)檢測并驗證催化乳清酸合成的關(guān)鍵酶二氫乳清酸脫氫酶在高氨狀態(tài)下表達

12、抑制，14C-UTP摻入法檢測到RNA的合成障礙。
　　3差異代謝產(chǎn)物對高氨細胞模型的影響
　　與其他差異代謝物相比，乳清酸可以明顯逆轉(zhuǎn)氨對肝細胞的損傷作用。其具有促進肝細胞增殖再生，減輕凋亡，提高RNA合成的作用。
　　結(jié)論:
　　1．氨對肝細胞具有特異性損傷，其特異性機制與細胞膜上的氨轉(zhuǎn)運的相關(guān)蛋白RHCG和AQP8的表達有關(guān)，其損傷機制與氨啟動線粒體凋亡途徑有關(guān)。
　　2．氨導(dǎo)致肝細胞三羧酸循環(huán)、尿素