應(yīng)激及其藥物干預(yù)的代謝組學(xué)研究.pdf

1、應(yīng)激是指當(dāng)機(jī)體遭遇包括創(chuàng)傷、中毒、環(huán)境溫度劇烈變化、饑餓疲勞以及情緒緊張、恐懼、激動等各種強(qiáng)烈的刺激時(shí)，促腎上腺皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素的分泌即刻大幅度增加，引起機(jī)體的各種適應(yīng)性、抵抗性變化的一種機(jī)能狀態(tài)。急性應(yīng)激反應(yīng)是自我限制的過程，一旦應(yīng)激原的作用終止后，體內(nèi)的自穩(wěn)態(tài)得到恢復(fù)，應(yīng)激反應(yīng)的過程也就停止。但是如果應(yīng)激原的作用過度強(qiáng)烈，導(dǎo)致促皮質(zhì)素釋放激素和去甲腎上腺素大量分泌，就會影響生物體的多種生理機(jī)能。長期強(qiáng)烈身心應(yīng)激嚴(yán)重影響著的身心健

2、康，使機(jī)體出現(xiàn)抑郁癥、學(xué)習(xí)和記憶障礙、應(yīng)激性精神紊亂、癡呆、正常衰老過程加速、免疫力低下等等多系統(tǒng)疾患。目前研究應(yīng)激的絕大部分研究工作是圍繞生物體的組織和血液進(jìn)行的，而這些生物樣本的采集本身對于機(jī)體也構(gòu)成了另一種應(yīng)激，進(jìn)而可能對結(jié)果產(chǎn)生干擾和誤導(dǎo)；因?yàn)闄C(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)是一個(gè)動態(tài)的過程，這樣的研究缺乏對于動物整體狀態(tài)變化的連續(xù)監(jiān)測；應(yīng)激也是一個(gè)系統(tǒng)反應(yīng)，涉及到生物體的各個(gè)生理過程，影響眾多代謝通路，僅依靠幾個(gè)指標(biāo)遠(yuǎn)不能反映其全貌。對于長期應(yīng)

3、激所產(chǎn)生的亞健康狀態(tài)，以及藥物的抗應(yīng)激作用，在醫(yī)學(xué)上始終沒有找到合適的客觀評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。基于上述問題，我們希望采用一種無刺激、連續(xù)動態(tài)的系統(tǒng)的研究方法來評價(jià)機(jī)體的應(yīng)激狀態(tài)，探索其機(jī)制，從而建立客觀的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，為臨床和實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)激及相關(guān)疾病的判定提供依據(jù)。代謝組學(xué)又稱代謝物組學(xué)，是研究機(jī)體代謝產(chǎn)物譜變化的一種新的系統(tǒng)方法。作為一種“組學(xué)”科學(xué)，它借助高通量、高靈敏度與高精確度的現(xiàn)代分析技術(shù)，分析細(xì)胞、組織和其它生物樣本如血液或尿液中內(nèi)源性代謝

4、物整體組成并通過其復(fù)雜的、動態(tài)的變化來辯識和解析被研究對象的生理病理狀態(tài)。代謝物組是蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和基因組總體表達(dá)的結(jié)果，直接反映組織的生化狀態(tài)，能夠較靈敏地刻畫生命體生理病理狀態(tài)的變化，對于闡明生命復(fù)雜系統(tǒng)具有極為重要的意義。其最主要的特征就是高通量的實(shí)驗(yàn)和大規(guī)模的計(jì)算，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度出發(fā)，全面地綜合地考察機(jī)體代謝的變化。本文建立了代謝組學(xué)方法評價(jià)和研究急慢性應(yīng)激和相關(guān)疾病以及不同藥物干預(yù)的效果，主要內(nèi)容如下： 1.建立

5、急性冷應(yīng)激的代謝組學(xué)評價(jià)方法，采用氯甲酸乙酯衍生化GC/MS的分析方法測定冷應(yīng)激前后大鼠的尿樣，得到尿中小分子代謝物的指紋圖譜，結(jié)合模式識別(PCA和PLS-DA)等多維統(tǒng)計(jì)分析方法計(jì)算，峰響應(yīng)信號的主成分分析圖上顯示冷應(yīng)激前后正常大鼠尿液內(nèi)源性代謝物產(chǎn)生明顯分離，人參組則幾乎無分離。采用多維與單維統(tǒng)計(jì)結(jié)合的方法，找到與正常大鼠冷應(yīng)激前后分組相關(guān)的物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其中與應(yīng)激相關(guān)的部分代謝物如酪氨酸、色氨酸等物質(zhì)的相對含量產(chǎn)生顯著變化，從這些變

6、化可推測機(jī)體系統(tǒng)對冷應(yīng)激的應(yīng)答以及應(yīng)激后自我調(diào)節(jié)的過程，而這些物質(zhì)中絕大多數(shù)在人參皂苷組中變化的顯著性降低或者已無顯著性。從代謝物的角度證實(shí)冷應(yīng)激對機(jī)體作用、機(jī)體的自我恢復(fù)以及人參皂苷的抗應(yīng)激作用。 2.建立快速、高效的固相萃取-超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法同時(shí)定量測定大鼠尿液中的17種人參皂苷含量。選擇萃取回收率和重復(fù)性高的HLB固相萃取柱，同時(shí)優(yōu)化液相色譜及質(zhì)譜的儀器條件，方法的專屬性、線性范圍、回收率、日內(nèi)日間精密度和穩(wěn)定

7、性均符合生物樣本的測定要求。采用該方法測定了正常狀態(tài)下和冷應(yīng)激過后大鼠尿樣中皂苷類代謝物，結(jié)合多、單維數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)冷應(yīng)激可顯著改變Rc、Rb1等人參皂苷類物質(zhì)在尿液中的含量。 3.采用慢性應(yīng)激和孤養(yǎng)兩種經(jīng)典模型相結(jié)合的制模方法制作慢性輕度不可預(yù)見性的應(yīng)激抑郁模型，在27天的應(yīng)激過程中測定了敞箱實(shí)驗(yàn)行為學(xué)得分，24h攝食總量，體重，游泳不動時(shí)間，糖水消耗量，腎上腺、胸腺和脾重量以及腎上腺、胸腺以及脾指數(shù)，血漿促皮質(zhì)激素(ACTH

8、)和血清皮質(zhì)酮水平。以上指標(biāo)反應(yīng)了隨著應(yīng)激時(shí)間的延長，模型組大鼠逐漸呈現(xiàn)出類似于人類抑郁癥的癥狀。同時(shí)進(jìn)行的藥物干預(yù)中，人參皂苷組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著優(yōu)于模型組，氯米帕明和貫葉連翹提取物組總體優(yōu)于模型組，對動物的抑郁狀態(tài)表現(xiàn)出不同程度的干預(yù)作用。 4.建立慢性應(yīng)激的代謝組學(xué)評價(jià)方法，采用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合多維統(tǒng)計(jì)數(shù)學(xué)處理方法考察了慢性應(yīng)激過程中大鼠尿液樣本。內(nèi)源性代謝物峰響應(yīng)信號的主成分分析圖上顯示慢性應(yīng)激組9，27天大鼠尿樣可與0天

9、該組以同天對照組顯著分離。采用多維與單維統(tǒng)計(jì)結(jié)合的方法，分別找到與分組相關(guān)的物質(zhì)的交集。在差異表達(dá)的代謝物的交集中，第9天的結(jié)果與急性應(yīng)激的差異物質(zhì)部分一致，顯示了應(yīng)激反應(yīng)的特異性。第27天的結(jié)果與應(yīng)激和抑郁癥均有關(guān)系，這些物質(zhì)中絕大多數(shù)在給藥+應(yīng)激組中變化的顯著性降低或者無顯著性，因此可從代謝物的角度證實(shí)了這三種抗抑郁藥物的作用。 5.采用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合多維統(tǒng)計(jì)數(shù)學(xué)處理方法考察了慢性應(yīng)激后各組大鼠的腦組織提取液。內(nèi)源性代謝

10、物峰響應(yīng)信號的主成分分析圖上顯示慢性應(yīng)激組與對照組顯著分離，給藥組呈現(xiàn)不同程度的回歸趨勢。采用多維與單維統(tǒng)計(jì)結(jié)合的方法，分別找到與慢性應(yīng)激和正常大鼠分組相關(guān)的小分子內(nèi)源性代謝物，發(fā)現(xiàn)腦組織中與應(yīng)激以及抑郁相關(guān)代謝物的含量發(fā)生顯著變化，這些物質(zhì)中多數(shù)在給藥組中變化的顯著性降低或者無顯著性。三種抗抑郁劑中，人參皂苷改善的代謝物最多也最為明顯，貫葉連翹提取物次之，氯米帕明最少。從代謝組學(xué)的角度研究了慢性應(yīng)激導(dǎo)致的腦組織代謝物譜的變化，同時(shí)證實(shí)