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文檔簡介
1、六價鉻(Cr(Ⅵ))是一種人類生活環(huán)境中常見的重金屬污染物,廣泛存在于工業(yè)生產(chǎn)過程及排放廢棄物中,在我國一些地區(qū),近年來還發(fā)現(xiàn)土壤農(nóng)作物、水生生物以及飲用水中存在六價鉻污染,當(dāng)六價鉻經(jīng)口進入消化道及血液循環(huán)后,肝臟是主要的生物代謝器官,在此過程中可導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的損傷。在動物試驗中,研究證實了六價鉻誘導(dǎo)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)崩解、肝細(xì)胞凋亡等肝毒性效應(yīng)。體外試驗證實六價鉻可誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞線粒體損傷與細(xì)胞凋亡。線粒體是細(xì)胞能量合成的重要
2、細(xì)胞器,主要通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生能量ATP,后者與細(xì)胞生存密切相關(guān)。同時,線粒體結(jié)構(gòu)或功能的改變可引起凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)與細(xì)胞色素C的釋放,從而激活半胱氨酸蛋白酶(caspases)家族,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此,線粒體損傷不僅可導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙,而且還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,從分子水平上深入研究六價鉻誘導(dǎo)細(xì)胞能量代謝障礙及細(xì)胞凋亡,有助于闡明六價鉻的毒作用機制,從而為鉻中毒的生物學(xué)監(jiān)測與預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。
目的
3、:
初步探討六價鉻在不同作用時間、不同處理濃度干擾肝細(xì)胞能量代謝相關(guān)基因表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系,為深入研究六價鉻所致肝細(xì)胞凋亡的分子機制提供新的線索。
研究方法:
1.細(xì)胞生存率及細(xì)胞ATP水平檢測
采用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)對L-02肝細(xì)胞進行染毒,處理濃度以六價鉻離子(Cr(Ⅵ))計算,分別為:0、2、4、8、16、32μmol/L,處理時間為12、24、36小時(h)。
4、細(xì)胞經(jīng)Cr(Ⅵ)染毒后,細(xì)胞生存率和細(xì)胞內(nèi)ATP含量分別用分光光度法和熒光素生物發(fā)光法進行檢測,并對細(xì)胞生存率和細(xì)胞ATP相對含量進行統(tǒng)計分析。
2.細(xì)胞能量代謝相關(guān)基因mRNA水平檢測
L-02肝細(xì)胞經(jīng)Cr(Ⅵ)分別處理12、24、36 h后,細(xì)胞內(nèi)能量代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平采用逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)
(RT-qPCR)及2-△△CT法進行檢測分析,被檢測的能量代謝相關(guān)基因有線粒體
5、基因組編碼的電子呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ亞基1(NADH1)、復(fù)合體Ⅳ亞基1(COX1)、復(fù)合物Ⅴ亞基6(ATP-6S);細(xì)胞核基因組編碼的己糖激酶異構(gòu)體2(HK2)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)以及線粒體膜電壓依賴性陰離子通道VDAC1和腺苷酸轉(zhuǎn)運體ANT17個基因。
3.細(xì)胞ROS水平及細(xì)胞凋亡率檢測
細(xì)胞經(jīng)Cr(Ⅵ)染毒處理后,細(xì)胞ROS水平檢測通過原位裝載熒光探針2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-D
6、A),于37℃孵育20分鐘后,置于酶標(biāo)儀上以激發(fā)/發(fā)射波長(488/535 nm)進行氧化態(tài)二氯熒光素(DCF)熒光強度(FI)檢測。細(xì)胞凋亡率檢測首先用胰酶消化法收集細(xì)胞,然后裝載熒光探針異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白(Annexin V),再加入碘化丙啶(PI)雙染,置于流式細(xì)胞儀上進行熒光檢測(激發(fā)/發(fā)射波長為488/530 nm)。
4.siVDAC1肝細(xì)胞構(gòu)建
以人同源的VDA
7、C1基因159-177編碼區(qū)域作為siRNA靶序列,設(shè)計靶向該區(qū)域的siVDAC1寡核苷酸序列,插入到慢病毒質(zhì)粒載體pSilencerTM4.1,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌-DH5a中,使其成功克隆,并對陽性克隆菌落提取質(zhì)粒DNA,即為siVDAC1質(zhì)粒,然后采用脂質(zhì)體2000(lipofectamin TM2000)將siVDAC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至L-02肝細(xì)胞中,經(jīng)RT-qPCR和免疫印跡技術(shù)(WB)法證實VDAC1低表達(dá)肝細(xì)胞成功構(gòu)建,即為siV
8、DAC1肝細(xì)胞。
5.Cr(Ⅵ)對siVDAC1肝細(xì)胞影響的檢測
試驗分為兩個組,第一組采用siVDAC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的L-02肝細(xì)胞(即siVDAC1肝細(xì)胞)進行染毒,轉(zhuǎn)染48 h后即暴露于Cr(Ⅵ)溶液中,濃度分別為0、2、8、32μmol/L,處理時間為24h。第二組采用Cr(Ⅵ)對空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的L-02肝細(xì)胞(L-02-Scr)進行染毒處理,濃度分別為0、2、8、32μmol/L,處理時間為24 h。檢測的
9、觀察指標(biāo)為細(xì)胞ROS水平、VDAC1mRNA水平、細(xì)胞內(nèi)ATP水平及細(xì)胞凋亡率(方法同前)。
6.Cr(Ⅵ)對NAC預(yù)處理肝細(xì)胞影響的檢測
試驗分為兩個組,第一組采用Cr(Ⅵ)對L-02肝細(xì)胞進行單獨染毒,濃度分別為0、2、8、32μmol/L,處理時間為24 h。第二組采用N-乙酰半胱氨酸(NAC)20 mM對L-02肝細(xì)胞預(yù)處理6h后,再用Cr(Ⅵ)染毒處理(濃度及時間同第一組)。檢測的觀察指標(biāo)為細(xì)胞RO
10、S水平、VDAC1 mRNA水平、細(xì)胞內(nèi)ATP水平及細(xì)胞凋亡率(方法同前)。
結(jié)果:
1.Cr(Ⅵ)對細(xì)胞內(nèi)ATP含量的時效與量效關(guān)系
①4、8、16、32μM Cr(Ⅵ)經(jīng)12、24、36h染毒后,L-02肝細(xì)胞內(nèi)ATP相對水平12 h增加、24 h降低、36 h輕微回升,呈“V”形曲線變化特點。
②2μM Cr(Ⅵ)染毒對細(xì)胞內(nèi)ATP水平影響不明顯(P>0.05),32μM C
11、r(Ⅵ)染毒可致細(xì)胞內(nèi)ATP水平發(fā)生明顯改變,而與細(xì)胞生存率的降低無關(guān)(P<0.05),其作用閾值為4μM。
2.Cr(Ⅵ)對線粒體呼吸鏈和糖酵解限速酶基因mRNA表達(dá)的影響
①細(xì)胞采用Cr(Ⅵ)處理12h后,NADH1、ATP-6S基因mRNA表達(dá)無明顯變化,COX1基因mRNA水平明顯降低。Cr(Ⅵ)處理24 h后,NADH1和ATP-6S基因mRNA水平明顯升高,而COX1基因mRNA水平仍明顯偏低(P
12、<0.05)。Cr(Ⅵ)染毒36 h后,NADH1mRNA表達(dá)水平明顯下降,而COX1、ATP-6S基因mRNA表達(dá)水平明顯升高。
②Cr(Ⅵ)染毒12h后,HK2、PKM2基因mRNA表達(dá)水平變化不明顯。Cr(Ⅵ)染毒24、36 h后,HK2、PKM2基因mRNA均處于明顯的低表達(dá)水平,大多數(shù)處理組抑制率達(dá)90%以上(P<0.05)。
3.Cr(Ⅵ)對線粒體膜VDAC1、ANT1基因mRNA表達(dá)的影響
13、> ①Cr(Ⅵ)染毒后,細(xì)胞核VDAC1 mRNA表達(dá)在12 h明顯低于對照組水平,在24 h表達(dá)水平有所增加,染毒36 h后,各劑量組均明顯增加(P<0.05)。
②Cr(Ⅵ)處理12、24 h后,細(xì)胞內(nèi)ANT1 mRNA表達(dá)明顯低于對照組水平,而36 h處理后,細(xì)胞內(nèi)ANT1 mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組水平(P<0.05)。
4.Cr(Ⅵ)對siVDAC1肝細(xì)胞的毒效應(yīng)
Cr(Ⅵ)
14、對RNA干涉技術(shù)處理的siVDAC1肝細(xì)胞進行染毒后,與Cr(Ⅵ)對正常L-02肝細(xì)胞染毒結(jié)果相比較,在32μM Cr(Ⅵ)組,細(xì)胞核VDAC1 mRNA表達(dá)水平受到明顯抑制,細(xì)胞凋亡率明顯下調(diào),但凋亡率仍高于無Cr(Ⅵ)處理的siVDAC1肝細(xì)胞水平(P<0.05),細(xì)胞內(nèi)ATP水平則明顯回升,但仍低于無Cr(Ⅵ)處理的L-02肝細(xì)胞對照組(P<0.05),而Cr(Ⅵ)處理的siVDAC1肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平與L-02肝細(xì)胞比較無統(tǒng)計學(xué)
15、意義(P>0.05)。二種受試細(xì)胞的ROS、ATP水平以及凋亡率均與Cr(Ⅵ)處理濃度存在明顯量-效關(guān)系。
5.抗氧化劑NAC預(yù)處理對Cr(Ⅵ)細(xì)胞毒性的保護效應(yīng)
NAC預(yù)處理的L-02肝細(xì)胞經(jīng)Cr(Ⅵ)染毒后,與無NAC預(yù)處理的肝細(xì)胞比較,在32μM Cr(Ⅵ)組,細(xì)胞內(nèi)ROS水平、VDAC1 mRNA水平及細(xì)胞凋亡率明顯下降,而細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯回升(P<0.05)。但NAC預(yù)處理后,L-02肝細(xì)胞RO
16、S水平、VDAC1 mRNA水平、ATP水平及細(xì)胞凋亡率與Cr(Ⅵ)處理濃度存在明顯量-效關(guān)系。
結(jié)論:
1.Cr(Ⅵ)可對L-02肝細(xì)胞內(nèi)ATP水平產(chǎn)生影響,ATP水平在Cr(Ⅵ)染毒24 h明顯降低,提示Cr(Ⅵ)能影響細(xì)胞線粒體能量代謝,而36h后輕微的回升提示了線粒體功能的部分恢復(fù)。
2.線粒體呼吸鏈基因NADH1、ATP-6S在Cr(Ⅵ)12h處理變化不明顯,而24 h處理后其mRNA
17、表達(dá)出現(xiàn)異常增高,提示Cr(Ⅵ)可能對呼吸鏈電子傳遞產(chǎn)生干擾,從而使NADH主呼吸鏈功能呈代償性增強。
3.細(xì)胞核基因編碼的線粒體膜蛋白VDAC1在Cr(Ⅵ)12h處理后,其mRNA表達(dá)較低,在24 h處理后表達(dá)有所增加,而36h處理后各劑量組表達(dá)均明顯升高,提示Cr(Ⅵ)可能通過改變VDAC1基因表達(dá)水平而使線粒體膜通透性出現(xiàn)異常,導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙。
4.肝細(xì)胞VDAC1基因被干擾后,可在一定程度上減弱
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