Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)肝細(xì)胞能量代謝相關(guān)基因表達(dá)改變及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系.pdf

1、六價(jià)鉻(Cr(Ⅵ))是一種人類生活環(huán)境中常見(jiàn)的重金屬污染物，廣泛存在于工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程及排放廢棄物中，在我國(guó)一些地區(qū)，近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)土壤農(nóng)作物、水生生物以及飲用水中存在六價(jià)鉻污染，當(dāng)六價(jià)鉻經(jīng)口進(jìn)入消化道及血液循環(huán)后，肝臟是主要的生物代謝器官，在此過(guò)程中可導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的損傷。在動(dòng)物試驗(yàn)中，研究證實(shí)了六價(jià)鉻誘導(dǎo)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)崩解、肝細(xì)胞凋亡等肝毒性效應(yīng)。體外試驗(yàn)證實(shí)六價(jià)鉻可誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞線粒體損傷與細(xì)胞凋亡。線粒體是細(xì)胞能量合成的重要

2、細(xì)胞器，主要通過(guò)三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生能量ATP，后者與細(xì)胞生存密切相關(guān)。同時(shí)，線粒體結(jié)構(gòu)或功能的改變可引起凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)與細(xì)胞色素C的釋放，從而激活半胱氨酸蛋白酶(caspases)家族，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，線粒體損傷不僅可導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，而且還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從分子水平上深入研究六價(jià)鉻誘導(dǎo)細(xì)胞能量代謝障礙及細(xì)胞凋亡，有助于闡明六價(jià)鉻的毒作用機(jī)制，從而為鉻中毒的生物學(xué)監(jiān)測(cè)與預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。
　　 目的

3、：
　　 初步探討六價(jià)鉻在不同作用時(shí)間、不同處理濃度干擾肝細(xì)胞能量代謝相關(guān)基因表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為深入研究六價(jià)鉻所致肝細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供新的線索。
　　 研究方法:
　　 1.細(xì)胞生存率及細(xì)胞ATP水平檢測(cè)
　　 采用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)對(duì)L-02肝細(xì)胞進(jìn)行染毒，處理濃度以六價(jià)鉻離子(Cr(Ⅵ))計(jì)算，分別為:0、2、4、8、16、32μmol/L，處理時(shí)間為12、24、36小時(shí)(h)。

4、細(xì)胞經(jīng)Cr(Ⅵ)染毒后，細(xì)胞生存率和細(xì)胞內(nèi)ATP含量分別用分光光度法和熒光素生物發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)細(xì)胞生存率和細(xì)胞ATP相對(duì)含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 2.細(xì)胞能量代謝相關(guān)基因mRNA水平檢測(cè)
　　 L-02肝細(xì)胞經(jīng)Cr(Ⅵ)分別處理12、24、36 h后，細(xì)胞內(nèi)能量代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平采用逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)
　　 (RT-qPCR)及2-△△CT法進(jìn)行檢測(cè)分析，被檢測(cè)的能量代謝相關(guān)基因有線粒體

5、基因組編碼的電子呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ亞基1(NADH1)、復(fù)合體Ⅳ亞基1(COX1)、復(fù)合物Ⅴ亞基6(ATP-6S);細(xì)胞核基因組編碼的己糖激酶異構(gòu)體2(HK2)、M2型丙酮酸激酶（PKM2）以及線粒體膜電壓依賴性陰離子通道VDAC1和腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體ANT17個(gè)基因。
　　 3.細(xì)胞ROS水平及細(xì)胞凋亡率檢測(cè)
　　 細(xì)胞經(jīng)Cr(Ⅵ)染毒處理后，細(xì)胞ROS水平檢測(cè)通過(guò)原位裝載熒光探針2’，7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-D

6、A)，于37℃孵育20分鐘后，置于酶標(biāo)儀上以激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)(488/535 nm)進(jìn)行氧化態(tài)二氯熒光素(DCF)熒光強(qiáng)度(FI)檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率檢測(cè)首先用胰酶消化法收集細(xì)胞，然后裝載熒光探針異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白(Annexin V)，再加入碘化丙啶(PI)雙染，置于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行熒光檢測(cè)(激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488/530 nm)。
　　 4.siVDAC1肝細(xì)胞構(gòu)建
　　 以人同源的VDA

7、C1基因159-177編碼區(qū)域作為siRNA靶序列，設(shè)計(jì)靶向該區(qū)域的siVDAC1寡核苷酸序列，插入到慢病毒質(zhì)粒載體pSilencerTM4.1，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌-DH5a中，使其成功克隆，并對(duì)陽(yáng)性克隆菌落提取質(zhì)粒DNA，即為siVDAC1質(zhì)粒，然后采用脂質(zhì)體2000（lipofectamin TM2000）將siVDAC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至L-02肝細(xì)胞中，經(jīng)RT-qPCR和免疫印跡技術(shù)(WB)法證實(shí)VDAC1低表達(dá)肝細(xì)胞成功構(gòu)建，即為siV

8、DAC1肝細(xì)胞。
　　 5.Cr(Ⅵ)對(duì)siVDAC1肝細(xì)胞影響的檢測(cè)
　　 試驗(yàn)分為兩個(gè)組，第一組采用siVDAC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的L-02肝細(xì)胞（即siVDAC1肝細(xì)胞）進(jìn)行染毒，轉(zhuǎn)染48 h后即暴露于Cr(Ⅵ)溶液中，濃度分別為0、2、8、32μmol/L，處理時(shí)間為24h。第二組采用Cr(Ⅵ)對(duì)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的L-02肝細(xì)胞(L-02-Scr)進(jìn)行染毒處理，濃度分別為0、2、8、32μmol/L，處理時(shí)間為24 h。檢測(cè)的

9、觀察指標(biāo)為細(xì)胞ROS水平、VDAC1mRNA水平、細(xì)胞內(nèi)ATP水平及細(xì)胞凋亡率（方法同前）。
　　 6.Cr(Ⅵ)對(duì)NAC預(yù)處理肝細(xì)胞影響的檢測(cè)
　　 試驗(yàn)分為兩個(gè)組，第一組采用Cr(Ⅵ)對(duì)L-02肝細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)染毒，濃度分別為0、2、8、32μmol/L，處理時(shí)間為24 h。第二組采用N-乙酰半胱氨酸(NAC)20 mM對(duì)L-02肝細(xì)胞預(yù)處理6h后，再用Cr(Ⅵ)染毒處理（濃度及時(shí)間同第一組）。檢測(cè)的觀察指標(biāo)為細(xì)胞RO

10、S水平、VDAC1 mRNA水平、細(xì)胞內(nèi)ATP水平及細(xì)胞凋亡率（方法同前）。
　　 結(jié)果：
　　 1.Cr(Ⅵ)對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP含量的時(shí)效與量效關(guān)系
　　 ①4、8、16、32μM Cr(Ⅵ)經(jīng)12、24、36h染毒后，L-02肝細(xì)胞內(nèi)ATP相對(duì)水平12 h增加、24 h降低、36 h輕微回升，呈“V”形曲線變化特點(diǎn)。
　　 ②2μM Cr(Ⅵ)染毒對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP水平影響不明顯(P＞0.05)，32μM C

11、r(Ⅵ)染毒可致細(xì)胞內(nèi)ATP水平發(fā)生明顯改變，而與細(xì)胞生存率的降低無(wú)關(guān)(P＜0.05)，其作用閾值為4μM。
　　 2.Cr(Ⅵ)對(duì)線粒體呼吸鏈和糖酵解限速酶基因mRNA表達(dá)的影響
　　 ①細(xì)胞采用Cr(Ⅵ)處理12h后，NADH1、ATP-6S基因mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，COX1基因mRNA水平明顯降低。Cr(Ⅵ)處理24 h后，NADH1和ATP-6S基因mRNA水平明顯升高，而COX1基因mRNA水平仍明顯偏低（P

12、＜0.05）。Cr(Ⅵ)染毒36 h后，NADH1mRNA表達(dá)水平明顯下降，而COX1、ATP-6S基因mRNA表達(dá)水平明顯升高。
　　 ②Cr(Ⅵ)染毒12h后，HK2、PKM2基因mRNA表達(dá)水平變化不明顯。Cr(Ⅵ)染毒24、36 h后，HK2、PKM2基因mRNA均處于明顯的低表達(dá)水平，大多數(shù)處理組抑制率達(dá)90％以上(P＜0.05)。
　　 3.Cr(Ⅵ)對(duì)線粒體膜VDAC1、ANT1基因mRNA表達(dá)的影響

13、>　　 ①Cr(Ⅵ)染毒后，細(xì)胞核VDAC1 mRNA表達(dá)在12 h明顯低于對(duì)照組水平，在24 h表達(dá)水平有所增加，染毒36 h后，各劑量組均明顯增加(P＜0.05)。
　　 ②Cr(Ⅵ)處理12、24 h后，細(xì)胞內(nèi)ANT1 mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組水平，而36 h處理后，細(xì)胞內(nèi)ANT1 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組水平(P＜0.05)。
　　 4.Cr(Ⅵ)對(duì)siVDAC1肝細(xì)胞的毒效應(yīng)
　　 Cr(Ⅵ)

14、對(duì)RNA干涉技術(shù)處理的siVDAC1肝細(xì)胞進(jìn)行染毒后，與Cr(Ⅵ)對(duì)正常L-02肝細(xì)胞染毒結(jié)果相比較，在32μM Cr(Ⅵ)組，細(xì)胞核VDAC1 mRNA表達(dá)水平受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡率明顯下調(diào)，但凋亡率仍高于無(wú)Cr(Ⅵ)處理的siVDAC1肝細(xì)胞水平(P＜0.05)，細(xì)胞內(nèi)ATP水平則明顯回升，但仍低于無(wú)Cr(Ⅵ)處理的L-02肝細(xì)胞對(duì)照組(P＜0.05)，而Cr(Ⅵ)處理的siVDAC1肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平與L-02肝細(xì)胞比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、意義(P＞0.05)。二種受試細(xì)胞的ROS、ATP水平以及凋亡率均與Cr(Ⅵ)處理濃度存在明顯量-效關(guān)系。
　　 5.抗氧化劑NAC預(yù)處理對(duì)Cr(Ⅵ)細(xì)胞毒性的保護(hù)效應(yīng)
　　 NAC預(yù)處理的L-02肝細(xì)胞經(jīng)Cr(Ⅵ)染毒后，與無(wú)NAC預(yù)處理的肝細(xì)胞比較，在32μM Cr(Ⅵ)組，細(xì)胞內(nèi)ROS水平、VDAC1 mRNA水平及細(xì)胞凋亡率明顯下降，而細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯回升(P＜0.05)。但NAC預(yù)處理后，L-02肝細(xì)胞RO

16、S水平、VDAC1 mRNA水平、ATP水平及細(xì)胞凋亡率與Cr(Ⅵ)處理濃度存在明顯量-效關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1.Cr(Ⅵ)可對(duì)L-02肝細(xì)胞內(nèi)ATP水平產(chǎn)生影響，ATP水平在Cr(Ⅵ)染毒24 h明顯降低，提示Cr(Ⅵ)能影響細(xì)胞線粒體能量代謝，而36h后輕微的回升提示了線粒體功能的部分恢復(fù)。
　　 2.線粒體呼吸鏈基因NADH1、ATP-6S在Cr(Ⅵ)12h處理變化不明顯，而24 h處理后其mRNA

17、表達(dá)出現(xiàn)異常增高，提示Cr(Ⅵ)可能對(duì)呼吸鏈電子傳遞產(chǎn)生干擾，從而使NADH主呼吸鏈功能呈代償性增強(qiáng)。
　　 3.細(xì)胞核基因編碼的線粒體膜蛋白VDAC1在Cr(Ⅵ)12h處理后，其mRNA表達(dá)較低，在24 h處理后表達(dá)有所增加，而36h處理后各劑量組表達(dá)均明顯升高，提示Cr(Ⅵ)可能通過(guò)改變VDAC1基因表達(dá)水平而使線粒體膜通透性出現(xiàn)異常，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙。
　　 4.肝細(xì)胞VDAC1基因被干擾后，可在一定程度上減弱