羊膜載體對子宮內(nèi)膜細(xì)胞HGF、MMP-9、VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、近年來隨著人流、藥流手術(shù)及宮腔操作的增多，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜基底部全部或部分缺損、變薄，使子宮前后壁粘連、宮腔閉鎖,宮腔容積減小，引起患者月經(jīng)改變和生育異常。因此，宮腔粘連已成為婦科常見病之一，并且成為不孕、流產(chǎn)、早產(chǎn)的一項重要原因?，F(xiàn)階段宮腔粘連尤其是重度粘連患者治愈率低下，手術(shù)分離后粘連易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響著廣大女性的身體及心理健康。因此宮腔粘連分離術(shù)后如何防止粘連復(fù)發(fā)、促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長的治療是臨床工作的一大難題。目前，宮腔鏡下宮腔粘連切除術(shù)

2、（TCRA）是宮腔粘連治療的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式，術(shù)后放置宮內(nèi)節(jié)育器、宮腔放置球囊、應(yīng)用生物膠及防粘連膜并配合人工周期藥物治療等方法對預(yù)防其再粘連有一定的臨床療效。然而中、重度宮腔粘連患者，宮腔內(nèi)創(chuàng)面較大，正常內(nèi)膜組織較少，更易再度形成粘連，以上方法對此類患者療效欠佳。有學(xué)者利用羊膜移植治療重度宮腔粘連，發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生從而降低宮腔再粘連的發(fā)生率。
　　羊膜具有抗原性低、促進(jìn)上皮化、減輕炎癥反應(yīng)、抑制纖維組織增生等作用，羊膜移植在眼

3、表重建及皮膚移植中均有所應(yīng)用，并取得了令人滿意的效果。做為一種特殊的低免疫原性的物質(zhì)，其擁有特殊的結(jié)構(gòu)及分泌功能，新鮮羊膜中含大量生物活性物質(zhì)，可以促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖分化，減少瘢痕形成及預(yù)防粘連等。目前羊膜已在各學(xué)科及手術(shù)領(lǐng)域廣為發(fā)展。近年來，羊膜的臨床應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，包括眼科、燒傷科、骨組織重建、泌尿系統(tǒng)等等，而在婦科，羊膜可以作為一種生物敷料應(yīng)用于陰道重建、宮頸形成，也有實驗證實新鮮羊膜移植入IUA分離術(shù)后的宮腔，可以較好的降低宮腔

4、再粘連的發(fā)生率，有很好的應(yīng)用前景。
　　目的：
　　本課題通過在新鮮羊膜基質(zhì)面培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞，觀察細(xì)胞在羊膜基質(zhì)面的生長情況，并采用Real time-PCR及ELISA兩種實驗方法比較以羊膜為載體培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞與體外正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞的肝細(xì)胞生長因子（HGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）及血管內(nèi)皮因子（VEGF）的表達(dá)水平，初步探索以人羊膜作為載體種植人子宮內(nèi)膜細(xì)胞的可行性，為探索子宮內(nèi)膜重建提供有效和來

5、源豐富的移植材料，并為探討羊膜移植預(yù)防宮腔粘連分子機(jī)制積累實驗數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　1.采用膠原酶消化及篩網(wǎng)過濾等方法體外分離培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化法對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定；采用胰酶消化、機(jī)械刮除等方法制備去除羊膜上皮細(xì)胞的羊膜外基質(zhì)支架。
　　2.將體外擴(kuò)增傳代的子宮內(nèi)膜細(xì)胞種植在去除羊膜上皮細(xì)胞的羊膜外基質(zhì)支架上作為實驗組，以無羊膜載體培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞為空白對照組。倒置顯微鏡下觀察兩組細(xì)

6、胞生長形態(tài)的變化，實時熒光定量PCR法測定各組細(xì)胞HGF、MMP-9、VEGF mRNA的表達(dá)水平，ELISA法測定各組細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)量的變化。
　　3.將實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，不同組間mRNA及蛋白相對表達(dá)量符合正態(tài)分布的定量資料，兩兩比較采用采用兩獨(dú)立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.子宮內(nèi)膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點及免疫組化結(jié)果：培養(yǎng)出的子宮內(nèi)膜細(xì)胞多為多角形，細(xì)胞兩端

7、有多個短小突起，細(xì)胞排列無極性，貼壁生長。隨著細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，細(xì)胞逐漸拉長成梭形，具有成纖維細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞生長周期一般為7-10天，第1天為潛伏生長期，第2-4天進(jìn)入對數(shù)生長期，5-6天后達(dá)平臺期，7天后逐漸萎縮消退。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞特異的波形蛋白抗體(Vimentin)染色呈陽性，陽性細(xì)胞的胞質(zhì)呈棕黃色，角蛋白(CK19)抗體染色陰性。
　　2.將第二代子宮內(nèi)膜細(xì)胞接種于羊膜載體2h后，細(xì)胞粘附羊膜基質(zhì)，呈小圓球狀、散在分布、折

8、光性較好，但尚未貼壁。12h后，細(xì)胞少量貼壁，逐漸聚集成團(tuán)、成片生長，與培養(yǎng)皿上生長增殖的子宮內(nèi)膜細(xì)胞形態(tài)相似，但細(xì)胞排列欠規(guī)則，細(xì)胞與細(xì)胞之間連接緊密，并有細(xì)胞拉長，相互交通呈網(wǎng)狀。l周左右可觀察到明顯成片生長的細(xì)胞。羊膜載體在培養(yǎng)的第10天左右開始出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。
　　3.在羊膜基質(zhì)面培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞，HGF mRNA含量為2.033±0.922， MMP-9 mRNA含量為1.356±0.399，VEGF mRNA

9、含量為0.976±0.597；對照組mRNA HGF含量為1.299±1.004，MMP-9含量為0.871±0.529，VEGF含量為0.426±0.193；三組因子mRNA表達(dá)實驗組均較對照組高,差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　4.ELISA檢測細(xì)胞裂解液MMP-9蛋白表達(dá)量，羊膜載體組為（0.762±0.085） ng/ml，對照組為(0.089±0.008)ng/ml，羊膜載體組較對照組MMP-9蛋白表達(dá)量高，