siRNA靶向沉默COX-2對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥在位、異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞VEGF、MMP-9表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）簡(jiǎn)稱(chēng)內(nèi)異癥，近年來(lái)越來(lái)越引起婦產(chǎn)科臨床的關(guān)注，多見(jiàn)于育齡期婦女，被定義為具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）出現(xiàn)在宮腔被粘膜覆蓋以外部位時(shí)引起的病癥。其所引起的痛經(jīng)、慢性盆腔疼痛、不孕等嚴(yán)重影響廣大婦女的身心健康甚至威脅到家庭和諧，且其發(fā)病率越來(lái)越高，目前，EMT約占育齡婦女的10％-15%，占痛經(jīng)婦女的40%-60%，不孕患者30%-40%合并EMT，而在EMT患者中，不孕癥的發(fā)

2、病率約40%-60%。EMT雖為良性疾病，卻具有和腫瘤相似的浸潤(rùn)、侵襲特征，被稱(chēng)為“良性癌”。異位內(nèi)膜除了可侵犯盆腔臟器和腹膜（以侵犯卵巢和宮骶韌帶最常見(jiàn)），還可侵犯子宮、子宮直腸陷凹、腹膜臟層、陰道直腸膈等部位，全身任何部位均可能發(fā)病。
　　近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均對(duì)EMT進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)與臨床研究，但至今尚未搞清其明確病因及發(fā)病機(jī)制，治療效果也十分有限。EMT的治療方法較多，其中以藥物(內(nèi)分泌)治療、手術(shù)治療和綜合治療為主，但只有

3、切除子宮和雙附件的根治性手術(shù)治療效果較為確切，其余治療方法均有很高的復(fù)發(fā)率。而切除子宮和雙附件無(wú)疑剝奪了廣大育齡期病患的生育權(quán)，且使她們徹底喪失內(nèi)分泌功能，這些都是不容忽視的問(wèn)題。目前尚未發(fā)現(xiàn)一種治療方法能夠既有較好的治療效果，又無(wú)嚴(yán)重副作用，針對(duì)EMT的大多數(shù)藥物均會(huì)導(dǎo)致體重增加、肝功能損傷以及絕經(jīng)期綜合征等副作用，長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)使用會(huì)引起嚴(yán)重的身心損害。因此，尋找更有效的EMT治療方法成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者共同關(guān)注的問(wèn)題。
　　環(huán)氧合酶-

4、2（cyclooxygenase-2，COX-2）是一種限速酶，可以催化磷脂花生四烯酸合成前列腺素類(lèi)物質(zhì)，其催化產(chǎn)生的前列腺素是一類(lèi)重要的炎癥因子，具有抑制細(xì)胞凋亡、抑制免疫監(jiān)視等多種活性，參與炎癥和腫瘤過(guò)程，并且可以通過(guò)多重途徑引起疼痛。COX-2基因首先被報(bào)道與消化道腫瘤發(fā)生有關(guān)，隨后的研究發(fā)現(xiàn)COX-2基因通過(guò)多種途徑參與了多種實(shí)體性腫瘤和EMT的發(fā)生、發(fā)展。
　　小干擾RNA（small interfering RNA,s

5、iRNA）技術(shù)是一項(xiàng)新近發(fā)展起來(lái)的基因治療手段，因其可以特異性剔除或關(guān)閉基因的表達(dá)，它具備許多優(yōu)勢(shì)，比如價(jià)格低廉、方便快捷、效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)等，已成為探索基因功能的主要手段，在腫瘤和傳染性疾病等方面已取得一定的研究成果。該技術(shù)的建立和發(fā)展，在理論上為EMT的治療提供了一個(gè)全新的策略。
　　目的：
　　利用siRNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)靶向沉默COX-2基因，觀察對(duì)EMT在位、異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(endometrial st

6、roma cell,ESC)環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9) mRNA、蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，探討COX-2在EMT發(fā)病機(jī)制中的作用及siRNA靶向沉默COX-2基因用于治療EMT的可行性。
　　材料與方法：

7、r>　　1.研究對(duì)象
　　選擇2013年12月至2014年9月在河南省鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院（即河南省婦幼保健院）婦科行腹腔鏡或開(kāi)腹手術(shù)的卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者30例，為EMT組，其中在位、異位內(nèi)膜組各30例，子宮內(nèi)膜炎除外的其它婦科良性疾病患者10例，為非EMT正常對(duì)照組，年齡在25-48歲（各組間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），術(shù)前3個(gè)月無(wú)激素使用史，診斷經(jīng)腹腔鏡、術(shù)后常規(guī)病理檢查證實(shí)。所有標(biāo)本的獲取均經(jīng)過(guò)患者知情同意。手術(shù)室中獲取無(wú)

8、菌標(biāo)本后立即置于4℃預(yù)冷的含有雙抗(青霉素、鏈霉素各100IU/ml)的無(wú)菌DMEM/F-12（FD）培養(yǎng)液中，1小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室在生物安全柜中進(jìn)行培養(yǎng)。
　　2.試驗(yàn)方法
　?。?）分離、培養(yǎng)EMT在位、異位ESC各30例，將在位、異位ESC分別分為3組（n=10）：siRNA干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，前兩組分別注入COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物(含COX-2siRNA150pmol和脂質(zhì)體lip20005ul)和

9、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染復(fù)合物(含陰性對(duì)照siRNA150pmolul和脂質(zhì)體lip20005ul),同時(shí)分離、培養(yǎng)非EMT的正常ESC10例作為正常對(duì)照組。
　?。?）利用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Real time RT-PCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染前、后EMT在位、異位ESC和正常對(duì)照組ESC COX-2、VEGF及MMP-9基因mRNA的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染后48h，采用上述方法篩選出一條抑制效率最佳的siRNA序列用于后續(xù)試驗(yàn)；
　

10、?。?）采用蛋白印跡法（Western Blotting）檢測(cè)轉(zhuǎn)染前、后內(nèi)異癥在位、異位ESC和正常對(duì)照組ESC COX-2、VEGF及MMP-9基因蛋白的表達(dá)水平。
　　（4）轉(zhuǎn)染后48h，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組ESC的凋亡水平。
　　結(jié)果：
　　1.分別培養(yǎng)內(nèi)異癥在位、異位ESC32例、35例，最終均成功30例；10例正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，均成功。
　　2.3條COX-2 siRNA序列均有一定抑制效果，以s

11、iRNA-2抑制效率最佳。
　　3.EMT在位、異位ESC空白對(duì)照組COX-2、VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)量均高于正常對(duì)照組(均P<0.05)，且異位內(nèi)膜組明顯高于在位內(nèi)膜組(P<0.05)；靶向沉默COX-2基因后，干擾組在位、異位ESC COX-2、VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)量與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比,均降低(均P<0.05)，而后兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，且異位內(nèi)膜組較在位內(nèi)膜組ESC C

12、OX-2、VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)水平下降更明顯(P<0.05)。
　　4.EMT在位、異位ESC空白對(duì)照組COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)量均高于正常對(duì)照組(均P<0.05)，且異位內(nèi)膜組明顯高于在位內(nèi)膜組(P<0.05)；靶向沉默COX-2基因后，干擾組在位、異位ESC COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)量與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比,均降低(均P<0.05)，而后兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05

13、)，且異位內(nèi)膜組較在位內(nèi)膜組ESC COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)水平下降更明顯(P<0.05)。
　　5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA干擾組在位、異位ESC凋亡率較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組增加(均P<0.05)，而后兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，且異位內(nèi)膜組較在位內(nèi)膜組細(xì)胞凋亡更明顯(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.COX-2基因可能在內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。
　　2.s