蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類物質(zhì)對(duì)HER2過(guò)表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的作用.pdf

1、目的:人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(Human epidermal growth factor receptor2，HER2)是一個(gè)在乳腺癌中頻繁過(guò)表達(dá)的原癌基因，是人類表皮生長(zhǎng)因子受體家族的成員，HER2陽(yáng)性乳腺腫瘤具有快速增長(zhǎng)，高侵襲性，早期轉(zhuǎn)移以及頻繁的中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，患者接受治療后效果相對(duì)較差等特點(diǎn)。典型的治療方法是通過(guò)抑制HER2信號(hào)通路聯(lián)合化學(xué)療法，約半數(shù)的HER2陽(yáng)性腫瘤都伴隨雌激素受體(estrogen receptor，E

2、R)的表達(dá)，因此治療方案也包括激素療法，其中最常用的藥物為ER拮抗劑他莫昔芬（tamoxifen，TAM）。膜受體HER2的酪氨酸激酶活性被激活后可導(dǎo)致下游一系列信號(hào)通路的活化，其中包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mTOR)通路。激活的下游通路又進(jìn)一步修飾和磷酸化轉(zhuǎn)錄因子和其他轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞周期相關(guān)組件，這些過(guò)程使得這些通路對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，并能提高腫瘤細(xì)

3、胞增殖和存活能力，增強(qiáng)轉(zhuǎn)移和血管生成能力。曲妥珠單抗是臨床上針對(duì)HER2過(guò)表達(dá)乳腺癌進(jìn)行治療的典型藥物，該藥屬于人工化的HER2單克隆抗體，通過(guò)與HER2胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合而阻止HER2二聚化活化。該藥在早期應(yīng)用時(shí)有顯著作用，但大部分病人會(huì)快速產(chǎn)生耐藥性。HER2與ER在下游通路中的相互作用對(duì)乳腺癌治療有重要影響，臨床前試驗(yàn)和新輔助療法試驗(yàn)表明在ER可以作為防御機(jī)制繞開(kāi)HER2受抑制產(chǎn)生的影響，例如拉帕替尼靶向治療HER2時(shí)會(huì)引起過(guò)多細(xì)胞存

4、活相關(guān)通路的恢復(fù)，其中包括雌激素受體ER，推測(cè)可能是通過(guò)持久的PI3K/AKT通路抑制和隨之發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)而引起ER合成增多。另有研究證明在乳腺癌激素療法中，HER2過(guò)表達(dá)是引起他莫昔芬耐藥性的原因之一，因此針對(duì)HER2及ER陽(yáng)性乳腺癌的治療方案成為研究的重點(diǎn)。作為傳統(tǒng)中藥，蟾酥不僅具有強(qiáng)心、抗炎等功效，還具有對(duì)抗實(shí)體腫瘤和白血病的作用。沙地蟾蜍素(arenobufagin，ARE)和蟾毒靈(bufalin，BU)是提取于蟾酥的兩種

5、同源蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類單體，具有強(qiáng)心甾類結(jié)構(gòu)。已有現(xiàn)有稱強(qiáng)心甾類物質(zhì)具有抑制癌細(xì)胞增長(zhǎng)的能力。近期研究表明沙地蟾蜍素通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR通路而抑制肝癌細(xì)胞粘附、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，還能通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的血管生成進(jìn)而阻礙腫瘤發(fā)生。許多文章也報(bào)道蟾毒靈能夠引起白血病及肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。本課題旨在證明沙地蟾蜍素和蟾毒靈可能成為潛在的乳腺癌輔助治療藥物。

6、　　方法:(1)為揭示蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯對(duì)HER2過(guò)表達(dá)乳腺癌的作用以及其對(duì)他莫昔芬藥效的影響，我們?cè)诒菊n題中使用了T47D、MCF-7細(xì)胞株以及HER2基因過(guò)表達(dá)修飾的細(xì)胞株T47D/HER2和MCF-7/HER2。(2)使用MTT、克隆形成和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證沙地蟾蜍素和蟾毒靈對(duì)乳腺癌細(xì)胞生存、增殖能力及遷移能力等生物學(xué)功能的影響。(3)通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞存活增殖相關(guān)的重要通路與關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平變化，包括SRCs、E

7、RK、AKT以及凋亡相關(guān)蛋白PARP。(4)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。
　　結(jié)果:(1) MTT以及克隆形成實(shí)驗(yàn)證明沙地蟾蜍素和蟾毒靈對(duì)乳腺癌T47D和T47D/HER2細(xì)胞的存活以及增殖能力有顯著抑制作用，并表明該類藥物在低劑量時(shí)也能有效抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。與他莫昔芬聯(lián)合用藥后進(jìn)行MTT的結(jié)果表明兩種藥物能明顯提高他莫昔芬對(duì)HER2過(guò)表達(dá)乳腺癌細(xì)胞存活以及增殖能力的抑制作用。(2)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明沙地蟾蜍素和蟾毒

8、靈能下調(diào)HER2的表達(dá)水平，抑制AKT和ERK的磷酸化，降低SRC-1、SRC-3和E2F1在細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)水平，凋亡標(biāo)志蛋白PARP的降低以及其切割產(chǎn)物Cleaved-PARP的增多表明細(xì)胞凋亡水平的升高。此外該類藥物還能引起三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的凋亡以及SRC-1與SRC-3表達(dá)水平的下降。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果顯示在沙地蟾蜍素和蟾毒靈處理下T47D、MCF-7、T47D/HER2和MCF-7/HE

9、R2細(xì)胞的G2/M期比例顯著升高，即發(fā)生G2/M期阻滯。
　　結(jié)論:本課題證明蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類單體沙地蟾蜍素(ARE)與蟾毒靈(BU)能夠抑制HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的存活與增殖能力，并能顯著增強(qiáng)他莫昔芬對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞增殖能力的抑制作用。通過(guò)對(duì)HER2相關(guān)通路的研究，我們證明了ARE和BU能夠有效降低雌激素受體共激活因子SRC-1與SRC-3的蛋白水平，并能抑制AKT與ERK的磷酸化，引起細(xì)胞周期G2/M期阻滯與細(xì)胞凋亡