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文檔簡介
1、目的:
研究表明,HER2信號通路中任一環(huán)節(jié)發(fā)生改變,都可能導(dǎo)致曲妥珠單抗治療抵抗。目前已發(fā)現(xiàn)的抵抗機制包括:HER家族受體與胰島素樣生長因子1受體(insu-lin-like growth factor1 receptor,IGF-1R)信號增加;HER2截短突變體p95-HER2的累積;PI3K/AKT/mTOR信號通路的異常活化。除了這些可能導(dǎo)致HER2陽性乳腺癌細(xì)胞對曲妥珠單抗治療抵抗的機制外,JAK/STAT通路的激
2、活也可能是引起抵抗的另一重要機制,但目前相關(guān)報道很少。
JAK是一類非受體型酪氨酸激酶,該家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2四個成員。JAK激活后可以磷酸化STAT而使后者活化,從而構(gòu)成JAK/STAT信號通路。JAK/STAT信號通路在多種腫瘤組織中均存在過度激活的現(xiàn)象。在乳腺癌組織中,總的STAT3與磷酸化STAT3的表達水平均顯著高于正常乳腺組織,且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān)。但STAT3的激活是否與乳腺癌
3、細(xì)胞對曲妥珠單抗的治療抵抗有關(guān)目前尚未見報道。因此,本研究擬首先以HER2陽性的乳腺癌細(xì)胞為研究對象,觀察曲妥珠單抗處理過程中STAT3的激活情況,并利用基因沉默技術(shù)及特異性抑制劑聯(lián)合曲妥珠單抗處理來觀察細(xì)胞的反應(yīng),從而判斷STAT3的激活在乳腺癌細(xì)胞耐受曲妥珠單抗中的作用,以期為進一步的臨床治療提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。
AG490是目前研究中常用的一種JAK/STAT通路特異性抑制劑。AG490可以競爭性結(jié)合酪氨酸激酶JAK
4、2,從而抑制其活性。AG490抑制JAK的激活后,導(dǎo)致STAT3磷酸化被抑制,造成STAT3不能人核與相關(guān)DNA元件結(jié)合,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。當(dāng)前,AG490已成為臨床治療多種腫瘤的抗癌藥物,但AG490能否增敏曲妥珠單抗尚不清楚。
另外,由于激活的STAT3能上調(diào)抗凋亡基因Bcl-xL、Bcl-2與Mcl-1的表達,激活促血管生成生長因子VEGF的表達,還能上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclinsD1/D2以及促細(xì)胞增殖蛋白c
5、-myc與Survivin的表達,并且有下調(diào)促凋亡基因p53表達的作用。尤其最近研究發(fā)現(xiàn),抑癌基因SARI也可能參與了JAK/STAT信號介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生。SARI又稱為BATF2,在正常人組織中表達水平較高,而在相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞中表達水平降低。外源性表達SARI可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,而過表達SARI卻對正常細(xì)胞無明顯的增殖抑制效應(yīng)。但SARI抗癌的分子機制還沒完全清楚,特別是調(diào)控SARI表達的上游信號還不清楚。AG490作用后是否可通過
6、激活SARI來殺傷乳腺癌細(xì)胞也值得進一步探討。
方法:
通過CCK-8實驗測定不同濃度的曲妥珠單抗對HER2陽性細(xì)胞SK-BR3增殖的抑制作用,通過臺盼藍染色實驗測定不同濃度的曲妥珠單抗對HER2陽性細(xì)胞SK-BR3死亡的影響,通過克隆形成實驗測定不同濃度的曲妥珠單抗對HER2陽性細(xì)胞SK-BR3克隆形成能力的影響,通過免疫印跡實驗檢測曲妥珠單抗作用后SK-BR3細(xì)胞中STAT3的激活情況,然后通過siRNA沉默SK
7、-BR3細(xì)胞中的STAT3,免疫印跡實驗確定沉默效果,然后通過CCK-8實驗和臺盼藍實驗觀察沉默STAT3后曲妥珠單抗對SK-BR3細(xì)胞增殖與死亡的影響。再進一步使用STAT3抑制劑AG490單獨或與曲妥珠單抗聯(lián)合處理SK-BR3細(xì)胞,通過CCK-8實驗和臺盼藍實驗觀察不同處理對細(xì)胞增殖與死亡的影響。然后采用相同的策略,通過CCK-8實驗測定不同濃度的AG490分別對HER2陽性與HER2陰性細(xì)胞增殖的抑制作用,通過臺盼藍染色實驗測定不
8、同濃度的AG490分別對HER2陽性與HER2陰性細(xì)胞死亡的影響,通過克隆形成實驗測定不同濃度的AG490分別對HER2陽性與HER2陰性細(xì)胞克隆形成能力的影響,通過免疫印跡實驗檢測AG490作用后細(xì)胞中SARI的激活情況,然后通過siRNA沉默細(xì)胞中的SARI,免疫印跡實驗確定沉默效果,然后通過CCK-8實驗和臺盼藍實驗觀察沉默SARI后AG490對細(xì)胞增殖與死亡的影響。通過生物信息方法預(yù)測SARI基因啟動子區(qū)中存在的STAT3結(jié)合位
9、點,并采用PCR方法從乳腺癌細(xì)胞中擴增SARI基因的啟動子區(qū),并針對性的擴增包含或不包含STAT3結(jié)合位點的片段,將各片段插入報告基因載體pGL3中,然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,觀察AG490處理前后熒光素酶活性變化情況,從而確定AG490是否能夠通過上調(diào)SARI的轉(zhuǎn)錄來增強其表達并抗癌。
結(jié)果:
曲妥珠單抗能以劑量依賴的方式抑制SK-BR3細(xì)胞的增殖,0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml曲妥珠單抗的細(xì)胞相對增殖率
10、分別為76.22%、72.97%、61.08%、42.16%和23.78%。曲妥珠單抗也能以劑量依賴的方式促進SK-BR3細(xì)胞死亡,0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml曲妥珠單抗相對應(yīng)的細(xì)胞死亡率分別為:10.35±1.66%、18.37±2.49%、31.97±3.08%、46.78±5.67%、63.77±7.81%。與對照組相比,曲妥珠單抗還能以劑量依賴的方式抑制SK-BR3細(xì)胞的克隆形成,0.25、0.5、1.0
11、、2.0、4.0 mg/ml曲妥珠單抗相對應(yīng)的細(xì)胞克隆形成率分別為:64.79±8.38%、35.21±13.29%、26.03±10.79%、16.29±10.34%、6.18±6.06%。曲妥珠單抗還可以濃度依賴性地激活SK-BR3細(xì)胞中的STAT3信號通路,體現(xiàn)為磷酸化STAT3水平顯著升高。用特異性siRNA沉默SK-BR3細(xì)胞中的STAT3后,CCK-8實驗分析發(fā)現(xiàn)可以顯著增強曲妥珠單抗對SK-BR3細(xì)胞的增殖抑制率,臺盼藍實
12、驗分析發(fā)現(xiàn)可以顯著增加曲妥珠單抗對SK-BR3細(xì)胞的死亡率。CCK-8實驗結(jié)果表明,與AG490單獨處理組或曲妥珠單抗單獨處理組相比,AG490聯(lián)合曲妥珠單抗可以顯著增加SK-BR3細(xì)胞的增殖抑制率;臺盼藍實驗結(jié)果也表明,與AG490單獨處理組或曲妥珠單抗單獨處理組相比,AG490聯(lián)合曲妥珠單抗可以顯著增加SK-BR3細(xì)胞的死亡率。本研究結(jié)果進一步證明,抑制STAT3信號通路確實可以增加曲妥珠單抗對SK-BR3細(xì)胞的殺傷率。
13、AG490能以劑量依賴的方式抑制SK-BR3細(xì)胞與MDA-MB-231細(xì)胞的增殖,AG490在兩種細(xì)胞中的IC50值分別為43.281μM與28.327μM。AG490也能以劑量依賴的方式促進SK-BR3細(xì)胞與MDA-MB-231細(xì)胞死亡,SK-BR3細(xì)胞的對照組死亡率為1.02±0.24%,AG490處理組按照濃度梯度升高(25、50、100μM)關(guān)系相對應(yīng)的死亡率分別為:5.78±1.67%、16.89±2.67%、31.08±4.
14、65%;而在MDA-MB-231細(xì)胞,對照組死亡率為1.77±0.66%,AG490處理組按照濃度梯度升高(25、50、100μM)關(guān)系相對應(yīng)的死亡率分別為:8.05±2.05%、27.26±2.89%、44.18±4.98%。與對照組相比,AG490還能以劑量依賴的方式抑制SK-BR3細(xì)胞與MDA-MB-231細(xì)胞的克隆形成。在SK-BR3細(xì)胞,對照組與實驗組(依濃度升高)的細(xì)胞克隆數(shù)分別為:559±52、361±38、206±29、
15、117±15個;在MDA-MB-231細(xì)胞,對照組與實驗組(依濃度升高)的細(xì)胞克隆數(shù)分別為:389±42、211±23、149±17、68±13個。定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),隨AG490處理濃度的升高,SK-BR3與MDA-MB-231細(xì)胞中SARI的mRNA水平均顯著升高;Western blot分析也進一步證實,AG490可以劑量依賴的方式增強SK-BR3與MDA-MB-231細(xì)胞中SARI蛋白的表達水平。沉默SARI后AG490對MDA
16、-MB-231細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)降低。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在位于-1787到-1797位置存在1個經(jīng)典的STAT3結(jié)合位點。將包含SARI啟動子區(qū)不同大小的兩個片段(-1到-2000bp,-1到-1700bp)分別克隆到報告質(zhì)粒pGL3-basic中,并與對照質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后進行熒光素酶報告基因檢測,發(fā)現(xiàn)不含STAT3結(jié)合位點的-1到-1700bp片段在AG490處理前后熒光素酶活性無明顯改變,而包含該結(jié)合位點的-
17、1到-2000bp片段則在AG490處理后熒光素酶活性顯著增高。這一結(jié)果說明AG490作用后可通過增加SARI啟動子活性而增強SARI的轉(zhuǎn)錄來提高其表達,這一過程可能與AG490對STAT3的抑制及STAT3對SARI啟動子活性的抑制相關(guān)。
結(jié)論:
1.曲妥珠單抗可以劑量依賴性地抑制HER2陽性乳腺癌細(xì)胞的增殖、促進其死亡、并抑制其細(xì)胞克隆的形成。
2.曲妥珠單抗處理導(dǎo)致HER2陽性乳腺癌細(xì)胞中STAT3的
18、激活,沉默STAT3或抑制STAT3的活性均能增強HER2陽性乳腺癌細(xì)胞對曲妥珠單抗的敏感性。
3.AG490可以劑量依賴性地分別抑制HER2陽性與HER2陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、促進其死亡、并抑制其細(xì)胞克隆的形成。
4.AG490處理導(dǎo)致HER2陽性與HER2陰性乳腺癌細(xì)胞中SARI表達上調(diào),沉默SARI后能降低乳腺癌細(xì)胞對AG490的敏感性。
5.SARI基因的啟動子區(qū)存在STAT3的結(jié)合位點,不含該結(jié)合
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