細(xì)胞自噬在HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞獲得Lapatinib耐藥過(guò)程中的機(jī)制和功能研究.pdf

1、從20世紀(jì)70年代末開(kāi)始，全球乳腺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)。2014年美國(guó)腫瘤學(xué)會(huì)在《腫瘤臨床醫(yī)生期刊》（A Cancer Journal for Clinicians）公布的數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌依舊是女性人群中最為常見(jiàn)的癌癥。據(jù)其預(yù)計(jì)，乳腺癌將占女性所有新發(fā)腫瘤（Estimated New Cases）的四分之一左右，死亡率（Estimated Deaths）也僅次于肺癌，排名第二。中國(guó)雖然不是乳腺癌的高發(fā)國(guó)家，但近年來(lái)發(fā)病率卻一直處于高

2、位。截至2008年，中國(guó)乳腺癌新發(fā)數(shù)量占全世界的12.2％，死亡數(shù)量則占到了9.6%。尤其值得注意的是，我國(guó)乳腺癌患者的平均診斷年齡約為50歲，與西方女性的平均年齡（約為61歲）相比提前了約11年時(shí)間。由此可見(jiàn)，無(wú)論在西方國(guó)家還是在我國(guó)，乳腺癌都已成為女性最常見(jiàn)的、發(fā)病率最高的惡性腫瘤，而且在我國(guó)的發(fā)病年齡正趨于年輕化，嚴(yán)重影響著女性身心健康。
　　目前，乳腺癌的治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療和分子靶向藥物治療等多種手段。其中，

3、分子靶向藥物的研發(fā)和應(yīng)用最為迅速。依據(jù)人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（Human Epidermal growth factor Receptor-2，HER2）、雌激素受體（Estrogen Receptor，ER）和孕激素受體（Progesterone Receptor，PR）三種受體在乳腺癌細(xì)胞的不同表達(dá)水平，將乳腺癌分為四種不同的亞型，即Luminal A型、Luminal B型、HER2陽(yáng)性和三陰型。HER2是一個(gè)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)

4、的細(xì)胞膜表面受體，它的高表達(dá)與乳腺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)顯示，有近1/4的乳腺癌患者屬于 HER2陽(yáng)性，而這類(lèi)患者的預(yù)后較差，且惡性程度較高。因此，針對(duì) HER2受體的分子靶向藥物研究顯得尤為重要。美國(guó)Genentech公司研發(fā)了人源化HER2單克隆抗體--曲妥珠單抗（Trastuzumab，商品名：赫塞汀，Herceptin），因其聯(lián)合化療可以顯著延長(zhǎng)HER2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的總生存期，于1998年獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局

5、(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)上市，成為單克隆抗體類(lèi)靶向藥物研究的里程碑。隨后，F(xiàn)DA又批準(zhǔn)將 Trastuzumab第一個(gè)用于乳腺癌的新輔助治療。不幸的是，大部分HER2陽(yáng)性患者在使用Trastuzumab治療1年左右會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。
　　拉帕替尼（Lapatinib）是葛蘭素史克公司（GlaxoSmithKline，GSK）研發(fā)的一種針對(duì) HER2的新型小分子抑制

6、劑，它可以同時(shí)抑制 HER2和表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）胞內(nèi)段的ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷下游增殖信號(hào)的傳遞，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。2007年該藥被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，與卡培他濱（Capecitabine）合并治療晚期或復(fù)發(fā)性的乳腺癌，特別是已經(jīng)發(fā)生Trastuzumab耐藥的乳腺癌。臨床研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用Capecitabine和Lapatinib治療復(fù)發(fā)性晚期或轉(zhuǎn)移性乳

7、腺癌，可明顯延長(zhǎng)疾病的進(jìn)展時(shí)間（Time to Progression，TTP）和無(wú)疾病進(jìn)展生存期（Progression-Free Survival，PFS）。這證明Lapatinib對(duì)進(jìn)展期乳腺癌具有明顯的治療效果。研究表明，表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor，EGF）等配體與HER2受體結(jié)合后可以激活HER2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘發(fā)下游信號(hào)分子通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。HER2受體的活化可以誘導(dǎo)PI3K、Akt、mTOR

8、、p70SK等分子的活化，促使其發(fā)生磷酸化，加速腫瘤細(xì)胞的增殖。而Lapatinib則通過(guò)阻斷HER2下游促增殖信號(hào)的傳遞，抑制PI3K、Akt等分子活化和HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的增殖，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。可是，臨床試驗(yàn)顯示Lapatinib的臨床反應(yīng)率僅有24%左右，獲益率也處于較低水平。原發(fā)性或獲得性耐藥嚴(yán)重制約著Lapatinib在臨床的應(yīng)用，治療失敗的主要原因是產(chǎn)生耐藥，闡明其耐藥性機(jī)制并進(jìn)行有效的干預(yù)，將有助于進(jìn)一步提高該

9、藥的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　自噬（Autophagy）是細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)不足、藥物干預(yù)等極端條件下進(jìn)行自我保護(hù)的重要機(jī)制之一。自噬可以促進(jìn)細(xì)胞生存，但是過(guò)度的自噬卻促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，究竟“細(xì)胞自噬是促進(jìn)還是抑制腫瘤細(xì)胞的存活”是一個(gè)充滿爭(zhēng)議的話題。近期有研究表明，細(xì)胞自噬可能參與腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性的過(guò)程，而 PI3K/Akt/mTOR、LKBI/AMPK/mTOR等信號(hào)通路可能是細(xì)胞自噬發(fā)生的主要上游調(diào)控分子。同時(shí)，細(xì)胞中的活性氧類(lèi)（Re

10、active Oxygen Species，ROS）與自噬也表現(xiàn)出密切的關(guān)系，參與到腫瘤細(xì)胞耐藥性的獲得過(guò)程中，激活耐藥細(xì)胞的ROS水平可能成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的重要機(jī)制之一。
　　基于以上研究背景，我們?cè)噲D通過(guò)本課題的探索回答如下問(wèn)題：（1）在HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞獲得Lapatinib耐藥性的過(guò)程中，細(xì)胞自噬是否發(fā)揮重要作用？（2）是否可以通過(guò)抑制細(xì)胞自噬過(guò)程恢復(fù)Lapatinib的治療敏感性？（3）細(xì)胞自噬活化的分子機(jī)制是什么？

11、（4）小檗堿（Berberine，BR）等藥物是否可以通過(guò)上調(diào)ROS水平殺傷Lapatinib耐藥細(xì)胞？通過(guò)解答以上問(wèn)題，我們將明確HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞獲得Lapatinib耐藥性的機(jī)制，并為恢復(fù)Lapatinib的治療敏感性提供重要理論依據(jù)。
　　研究方法和結(jié)果：
　　1.具有Lapatinib耐藥性的HER2陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選及耐藥性分析：（1）利用Lapatinib處理HER2高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系BT-474和AU-5

12、65，逐漸增加Lapatinib的作用濃度，維持篩選12個(gè)月，最終獲得具有Lapatinib耐藥性的細(xì)胞；（2）利用MTT、平板克隆和軟瓊脂克隆形成能力分析等方法對(duì)BT-474耐藥細(xì)胞（BT-474LapR）和AU-565耐藥細(xì)胞（AU-565LapR）的耐藥能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：所篩選的耐藥細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞增殖、平板克隆形成以及軟瓊脂克隆形成等多方面檢測(cè)均表現(xiàn)出穩(wěn)定的耐藥性，可以滿足后續(xù)機(jī)制研究的需要。
　　2.細(xì)胞自噬促進(jìn)HER2陽(yáng)

13、性細(xì)胞株獲得Lapatinib耐藥性的功能評(píng)價(jià)：（1）利用透射電鏡分析細(xì)胞自噬體是否在BT-474LapR和AU-565LapR細(xì)胞中增加；（2）用細(xì)胞自噬標(biāo)記分子GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)染BT-474和AU-565細(xì)胞系，并用激光共聚焦顯微鏡觀察自噬體的分布變化；（3）利用MTT、EDU、平板克隆和流式細(xì)胞術(shù)等方法對(duì)BT-474LapR和AU-565LapR細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，觀察細(xì)胞的功能變化；（4）利用細(xì)胞自噬的抑制劑3-甲基腺嘌呤（3

14、-Methyladenine,3-MA）、氯喹（Chloroquine，CQ）和巴伐洛霉素A（Bafilomycin A，BA）聯(lián)合Lapatinib作用耐藥細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞增殖能力和凋亡分析。結(jié)果：細(xì)胞自噬可以促進(jìn)HER2陽(yáng)性細(xì)胞株獲得Lapatinib耐藥性，抑制細(xì)胞自噬可以顯著增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)Lapatinib的治療敏感性。
　　3.細(xì)胞自噬在Lapatinib耐藥細(xì)胞中活化的機(jī)制分析：（1）利用Western-blottin

15、g技術(shù)分析 AMPK-mTOR信號(hào)通路相關(guān)分子在BT-474Par和BT-474LapR細(xì)胞中的表達(dá)差異；（2）利用AMPK磷酸化的抑制劑Compound C阻斷AMPK下游信號(hào)通路，分析其對(duì)耐藥細(xì)胞功能的影響。結(jié)果：磷酸化AMPK在BT-474LapR細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加，提示AMPK在耐藥細(xì)胞中處于活化狀態(tài)，這可能是誘發(fā)細(xì)胞自噬的主要原因。Compound C阻斷AMPK下游信號(hào)通路后，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化受到明顯的阻斷，細(xì)

16、胞水平的Lapatinib治療敏感性顯著增加。
　　4. Lapatinib耐藥細(xì)胞的ROS狀態(tài)分析及BR干預(yù)研究：（1）利用MTT、EdU、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)Lapatinib和/或BR對(duì)BT-474LapR細(xì)胞增殖和凋亡功能的影響；（2）利用ROS試劑盒檢測(cè)BR對(duì)BT-474Par和BT-474LapR細(xì)胞ROS水平的影響。結(jié)果：利用DCFH-DA標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)BT-474LapR細(xì)胞的ROS水平顯著低于 BT-

17、474Par細(xì)胞。BR可以通過(guò)上調(diào) ROS水平顯著增加耐藥細(xì)胞對(duì)Lapatinib的治療敏感性，并誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.所篩選的Lapatinib耐藥乳腺癌細(xì)胞系BT-474和AU-565具有穩(wěn)定的耐藥性；
　　2. Lapatinib耐藥細(xì)胞的自噬形成能力增加，并促進(jìn) HER2陽(yáng)性細(xì)胞獲得 Lapatinib耐藥性；
　　3.利用自噬抑制劑阻斷耐藥細(xì)胞的自噬過(guò)程有助于恢復(fù)耐藥細(xì)胞對(duì) Lapat