MicroRNA-let-7c對(duì)中耳膽脂瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、中耳膽脂瘤是一種在中耳和乳突腔內(nèi)的非腫瘤的疾病，其病理學(xué)特征包括鱗狀上皮角化功能受損、上皮增生的同時(shí)伴有異常的上皮內(nèi)細(xì)微結(jié)構(gòu)的變化如微膽脂瘤的形成、基底膜的破壞、斷裂，膽脂瘤上皮下組織炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)等。臨床表現(xiàn)主要有耳痛、流膿、聽力下降，嚴(yán)重的可波及面神經(jīng)引起面癱、波及半規(guī)管導(dǎo)致眩暈及顱內(nèi)外的感染危及生命，而這一切的原因都是膽脂瘤對(duì)臨近骨質(zhì)的破壞吸收所致。
　　目前膽脂瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確。從分子生物學(xué)上研究發(fā)現(xiàn)多種因素，如增

2、生、凋亡、分化、炎癥、感染、骨質(zhì)破壞、脂類代謝、血管發(fā)生在膽脂瘤的形成和臨床表現(xiàn)方面有著一定的作用，其中增生、分化和凋亡的異常表現(xiàn)是膽脂瘤上皮的最基本特征。研究多以與正常皮膚上皮的生物學(xué)特性相比較，發(fā)現(xiàn)膽脂瘤上皮增殖的能力異常增高，這種高度的增殖同腫瘤細(xì)胞是類似的已達(dá)成共識(shí)，目前分歧最大的地方是關(guān)于凋亡，包括凋亡能力、凋亡發(fā)生的途徑及凋亡的意義。細(xì)胞凋亡（apoptosis）是一種自主性死亡過程，由特定基因控制，在多種病理生理過程中是不

3、可缺少的。一些學(xué)者認(rèn)為膽脂瘤上皮細(xì)胞的凋亡能力增加，過度凋亡導(dǎo)致的膽脂瘤上皮脫落形成的角化物的聚集同膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而且凋亡水平的變化同膽脂瘤的骨質(zhì)吸收與復(fù)發(fā)、殘留有關(guān)，而另一些研究的結(jié)果則傾向于膽脂瘤上皮細(xì)胞中凋亡能力受到了阻滯，導(dǎo)致凋亡周期延長(zhǎng)，細(xì)胞存在抗凋亡(anti-apoptosis)作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖、分化和死亡、遷移等多種生物學(xué)過程均受一類長(zhǎng)20-30nt的小RNA分子即Micro(mi)RNA的調(diào)

4、控，miRNA可以通過沉默其靶基
　　因表達(dá)來發(fā)揮調(diào)控作用，其作用方式是與靶基因mRNA3’端非翻譯區(qū)里的特異的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。多項(xiàng)研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后同miRNA的作用密切相關(guān)，同時(shí)miRNA在多種異常增生性疾病和代謝性疾病中也發(fā)生了明顯的變化。Friedland等以耳后皮膚組織為對(duì)照，采用RT-PCR技術(shù)首次檢測(cè)到八種miRNAs在膽脂瘤組織中的表達(dá)發(fā)生上調(diào)，其中miRNA-21的表達(dá)量改變最高，平均高于對(duì)照組4.4倍

5、，其下游靶基因?yàn)镻TEN和PDCD。2011年陳曉華研究了膽脂瘤上皮增殖和凋亡的相互關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，凋亡相關(guān)miRNA（apoptotic-associated miRNA）let-7a在膽脂瘤上皮表達(dá)上調(diào)。Let-7 microRNA家族是目前研究最廣泛的microRNA之一，在調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡方面均有作用途徑參與。在大多數(shù)腫瘤呈現(xiàn)低表達(dá)，提示let-7 microRNA的功能抑制與腫瘤的凋亡能力下降密切相關(guān)，而其在膽脂瘤中的高表

6、達(dá)提示其對(duì)膽脂瘤細(xì)胞的調(diào)控模式顯然不同于在腫瘤細(xì)胞中的作用方式。2015年張文靜從Let-7a microRNA對(duì)膽脂瘤細(xì)胞增生的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Let-7a microRNA通過抑制miRNA-21的作用而影響了細(xì)胞的增生，然而從miRNA水平研究膽脂瘤凋亡以及l(fā)et-7 microRNA參與中耳膽脂瘤凋亡的調(diào)控作用及具體途徑的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。相對(duì)于成人膽脂瘤來說，小兒膽脂瘤通常具有更強(qiáng)的攻擊性、侵襲性和復(fù)發(fā)性，既往研究表明凋

7、亡的差異與膽脂瘤骨質(zhì)破壞、復(fù)發(fā)有關(guān)，因而凋亡在上述兩種膽脂瘤中的表現(xiàn)有無差異以及miRNA在其中起到的作用如何值得進(jìn)一步研究。
　　目的：
　　1．觀察兒童膽脂瘤和成人膽脂瘤的凋亡能力的差異以及miRNA-let-7c及其靶蛋白Bcl-xl在兩種膽脂瘤中的表達(dá)情況，研究miRNA-let-7c與凋亡在膽脂瘤發(fā)生中的作用。
　　2．以攜帶miRNA-let-7c抑制體的慢病毒載體感染培養(yǎng)的膽脂瘤上皮角質(zhì)細(xì)胞，觀察下調(diào)mi

8、RNA-let-7c對(duì)膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中miRNA-let-7c及其靶基因Bcl-xl表達(dá)情況以及對(duì)細(xì)胞凋亡能力的影響。
　　3．觀察miRNA-let-7c inhibitor干擾膽脂瘤細(xì)胞凋亡的具體途徑，以期闡明膽脂瘤中miRNA-let-7c介導(dǎo)凋亡的發(fā)生機(jī)制，為我們認(rèn)識(shí)miRNA在中耳膽脂瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供新的理論依據(jù)。
　　第一部分、miRNA-let-7c在兒童膽脂瘤和成人膽脂瘤組織中的表達(dá)研究
　

9、　方法：
　　1．利用TUNEL法檢測(cè)29例兒童中耳膽脂瘤（年齡≤14歲）、29例成人中耳膽脂瘤（年齡≥18歲）的凋亡的差異，同時(shí)以相應(yīng)的兒童、成人耳后正常皮膚組織作為對(duì)照。
　　2．提取29例成人膽脂瘤組織、29例兒童膽脂瘤組織和耳后皮膚組織中的mRNAs，其濃度和純度的檢測(cè)通過紫外分光光度儀獲得。
　　3．利用 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)兒童膽脂瘤、成人膽脂瘤組織和其對(duì)照組中miRNA-let-7c的表達(dá)。
　　4

10、．采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)中耳膽脂瘤組織及對(duì)照組中Bcl-xl蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1．膽脂瘤上皮的凋亡同耳后皮膚組織相比，凋亡顯著高于皮膚組（P<0.05）；成人中耳膽脂瘤上皮的凋亡能力高于兒童膽脂瘤（P<0.05）；兩組耳后正常皮膚組織間的凋亡無差異（P＞0.05）。
　　2．成人膽脂瘤組織中 miRNA-let-7c的表達(dá)是對(duì)照組的11.96±0.09倍（P<0.05）；兒童膽脂瘤組織中miRNA-let-7

11、c的表達(dá)是對(duì)照組的7.94±0.04倍（P<0.05）；兒童和成人膽脂瘤間miRNA-let-7c的表達(dá)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；miRNA-let-7c在兩組耳后皮膚上皮間的相對(duì)表達(dá)量無差異（P＞0.05）。
　　3．MiRNA-let-7c下游靶基因Bcl-xl在兩種膽脂瘤中均呈現(xiàn)低表達(dá)，在成人膽脂瘤中的表達(dá)更低（P<0.05）。
　　第二部分、下調(diào)miRNA-let-7c對(duì)膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中miRNA-let-

12、7c及其靶基因的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡的影響
　　方法：
　　1.采用兩步消化法獲取中耳膽脂瘤上皮角質(zhì)細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。通過顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)而利用角質(zhì)細(xì)胞角蛋白抗體行免疫熒光化學(xué)方法檢測(cè)對(duì)角質(zhì)細(xì)胞的性質(zhì)進(jìn)行鑒定。
　　2．實(shí)驗(yàn)分組：miR-let-7c-inhibitor組（實(shí)驗(yàn)組），miR-let-7c-inhibitor NC組（陰性對(duì)照組），Mock組（空白對(duì)照組）。
　　3．利用攜帶miR

13、NA-let-7c inhibitor的慢病毒載體和miRNA-let-7c inhibitor NC的慢病毒載體感染膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)以空白對(duì)照組作為對(duì)照，培養(yǎng)后在熒光顯微鏡下觀察病毒感染效率，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-let-7c的表達(dá)是否下調(diào)。
　　4．利用western blotting和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-let-7c inhibitor干擾對(duì)膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中Bcl-xl蛋白和mRNA表達(dá)的影響。

14、r>　　5．將感染miRNA-let-7c inhibitor慢病毒后的膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞接種于96孔板中，共培養(yǎng)10天，每天取3孔通過檢測(cè)OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。
　　6．如上方法處理膽脂瘤細(xì)胞96h后，三組細(xì)胞均進(jìn)行碘化丙啶染色30分鐘后，用FCM法測(cè)定細(xì)胞凋亡及周期的改變。
　　7．如上方法處理膽脂瘤細(xì)胞96h后利用Annexin V-FITC染色法觀察細(xì)胞早期凋亡狀況，TUNEL原位酶標(biāo)記在熒光

15、顯微鏡下觀察膽脂瘤細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)果：
　　1．兩步消化法之后采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)可獲得足夠數(shù)量的膽脂瘤上皮角質(zhì)細(xì)胞，利用角蛋白抗體檢測(cè)提取獲得的膽脂瘤角質(zhì)上皮細(xì)胞的純度可達(dá)90％以上，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2．MiR-let-7c-inhibitor組的膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中miRNA-let-7c的表達(dá)顯著低于miR-let-7c-NC組和Mock組，miRNA-let-7c在miR-let-7c-NC組中的表達(dá)是m

16、iR-let-7c-inhibitor組的10.19±0.26倍，在Mock組中的表達(dá)是miR-let-7c-inhibitor組的10.92±0.31倍,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而在miR-let-7c-NC組和Mock組中的表達(dá)無差異（P＞0.05）。
　　3． Bcl-xl蛋白在膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞miR-let-7c-inhibitor組的表達(dá)較miR-let-7c-NC組和Mock組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P

17、<0.05）；在miR-let-7c-NC組和Mock組中的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。而Bcl-xl mRNA在miR-let-7c-inhibitor組的表達(dá)同miR-let-7c-NC組和Mock組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　4．MiRNA-let-7c inhibitor干擾后膽脂瘤上皮角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度較兩對(duì)照組明顯增快，第5天miR-let-7c-inhibitor組的OD值與miR-let-7c-NC組

18、和Mock組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第9天時(shí)miR-let-7c-inhibitor組因細(xì)胞密度過大，死亡細(xì)胞增多。
　　5．MiRNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞96h后，凋亡細(xì)胞比例下降，同miR-let-7c-NC組和Mock組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞周期分布出現(xiàn)明顯改變，S期細(xì)胞的數(shù)量增多（P＜0.05），G0/G1期細(xì)胞比例的下降（P＜0.05），即miRNA-l

19、et-7c inhibitor促使膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期。
　　6．MiRNA-let-7c inhibitor感染后96h，Annexin V-FITC檢測(cè)膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞的早期凋亡率明顯減少（P＜0.05）；TUNEL法檢測(cè)膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞凋亡比例也明顯減少（P＜0.05）。
　　第三部分、miRNA-let-7c參與膽脂瘤上皮角質(zhì)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究
　　方法：
　　1．利用western bl

20、otting檢測(cè)膽脂瘤組織及耳后皮膚組織中Bax、cytochrome C、smac、caspase-3和caspase-9的表達(dá)。
　　2．利用攜帶miRNA-let-7c inhibitor的慢病毒載體感染膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組：miR-let-7c-inhibitor組（實(shí)驗(yàn)組），miR-let-7c-NC組（陰性對(duì)照組），Mock組（空白對(duì)照組）。
　　3．如上方法處理膽脂瘤細(xì)胞72小時(shí)后利用western blo

21、tting檢測(cè)miR-let-7c inhibitor干擾對(duì)膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bax、pro-caspase-3、pro-caspase-9和cytochrome C、Smac蛋白表達(dá)的影響。
　　4．如上方法處理膽脂瘤細(xì)胞96小時(shí)后進(jìn)行JC-1染色，之后檢測(cè)三組細(xì)胞線粒體膜電位的差異。
　　5．如上方法處理膽脂瘤細(xì)胞96小時(shí)后利用分光光度儀檢測(cè)caspase-3和caspase-9的活性。
　　結(jié)

22、果：
　　1．膽脂瘤組織同耳后皮膚組織相比，Bax、cytochrome C、smac、caspase-3和caspase-9的表達(dá)均增加。
　　2．MiRNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞72h后Bax、cytochrome C、Smac的表達(dá)明顯減少（P<0.05），而pro-caspase-3、pro-caspase-9的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　3．MiRNA-

23、let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞96h后線粒體膜電位檢測(cè)中綠色熒光值明顯下降，表明線粒體膜電位上升（P<0.05）。
　　4．MiRNA-let-7c inhibitor感染膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞96h后caspase-3和caspase-9的活性明顯降低（P<0.05）。
　　結(jié)論
　　1．中耳膽脂瘤凋亡水平升高和miRNA-let-7c的表達(dá)上調(diào)，從miRNA水平驗(yàn)證了膽脂瘤的高凋亡狀態(tài)的非腫瘤性質(zhì)。

24、r>　　2．MiRNA-let-7c及其靶基因Bcl-xl和凋亡在兒童膽脂瘤和成人膽脂瘤中的表達(dá)有差異，這種差異提示兒童膽脂瘤的抗凋亡機(jī)制參與到了其發(fā)病機(jī)制中。
　　3．MiRNA-let-7c inhibitor慢病毒可有效沉默膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中miRNA-let-7c的表達(dá)，通過在翻譯水平的負(fù)性調(diào)控機(jī)制使其靶基因Bcl-xl蛋白的表達(dá)升高。
　　4．MiR-let-7c通過阻斷細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且以早中期細(xì)胞凋亡為主。