MiR-146b-5p對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1相關(guān)生物學(xué)特性的影響研究.pdf

1、背景：
　　MicroRNAs（小分子RNA，miRNAs）是一類全長約為21~25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子，miRNA可以識別特定的靶mRNA，轉(zhuǎn)錄以后信使RNA可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平，從而參與調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化、凋亡等生命活動。內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤為甲狀腺癌，其在惡性腫瘤中約占3％，已躍居頭頸部惡性腫瘤的首位，女性發(fā)病較多。近年來各國報(bào)道甲狀腺癌發(fā)病率的增長多以PTC為主。由于PTC早期多無明顯癥狀，常常

2、導(dǎo)致患者就診時(shí)已經(jīng)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或已侵犯周圍器官和組織。因此，探索PTC有效的治療靶點(diǎn)、尋找更安全有效的治療途徑一直是提高PTC生存率和生存質(zhì)量所亟待解決的難題。
　　在本實(shí)驗(yàn)前期的研究中，應(yīng)用高通量的 MicroRNA微陣列篩選不同分期的PTC組織和癌旁正常組織中差異表達(dá)的MicroRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p在早期和中晚期PTC組織中均呈明顯高表達(dá)，同時(shí)隨著腫瘤分期的增加，其表達(dá)水平有升高的趨勢，提示其在PTC發(fā)生、發(fā)展

3、和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。
　　MiR-146b位于10q24.32，與miR-146a具有高度的序列同源性。He及Sheu等通過基因芯片技術(shù)及RT-PCR方法研究發(fā)現(xiàn)miR-146b在PTC組織中過表達(dá)。Kim、Xing及Chou等發(fā)現(xiàn)miR-146b在BRAF基因突變組織中表達(dá)明顯升高， BRAF基因突變與PTC的侵襲性有關(guān)，這可能是miR-146b在PTC中過表達(dá)的一個(gè)分子機(jī)制。但目前尚未有關(guān)于miRNA-146b-5p與P

4、TC細(xì)胞生物學(xué)影響及相關(guān)機(jī)制的相關(guān)報(bào)道，通過本課題的研究，可望獲得miR-146b-5p對PTC的生物學(xué)行為影響的可靠證據(jù)，為確立miR-146b-5p作為PTC診斷和預(yù)后監(jiān)測的生物學(xué)指標(biāo)及治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　本次實(shí)驗(yàn)通過對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1細(xì)胞株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染使miR-146b-5p過表達(dá)，之后通過 CCK-8、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞儀檢測對比轉(zhuǎn)染前后PTC的增殖、凋亡、周期以及遷移、侵

5、襲能力的變化。從而探討miR-146b-5p過表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展的關(guān)系及miR-146b-5p在甲狀腺乳頭狀癌中的作用機(jī)制。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒載體構(gòu)建和慢病毒包裝并通過慢病毒侵染試驗(yàn)，使得hsa-mir-146b-5p在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞 TPC-1細(xì)胞株中得到穩(wěn)定高表達(dá)，這個(gè)試驗(yàn)為接下來進(jìn)一步研究 miR-146b-5p過表達(dá)對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞 TPC-1增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)特性的影響打下

6、堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.慢性毒質(zhì)粒的構(gòu)建：
　　（1）構(gòu)建miR-146b-5p過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒
　?。?）將過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞 TPC-1，獲取miR-146b-5p穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞單克隆
　　2. miR-146b-5p對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　（1）觀察 miR-146b-5p過表達(dá)對 TPC-1細(xì)胞增殖的影響：cck-8法檢測miR-146b-5

7、p過表達(dá)后可以明顯促進(jìn)TPC-1細(xì)胞的增殖，實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞數(shù)均有增加，但實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖更加明顯（P<0.05）。
　?。?）分析miR-146b-5p過表達(dá)對TPC-1細(xì)胞周期和凋亡的影響：通過流式細(xì)胞儀分析技術(shù)，可以看到實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞凋亡率之間有明顯差異，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率減少更為明顯。
　　（3）研究miR-146b-5 p過表達(dá)對TPC-1細(xì)胞遷移能力的影響:劃痕實(shí)驗(yàn)觀察過表過miR-146b-5p的細(xì)胞，

8、細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)果
　?。?）經(jīng)慢病毒包裝侵染將miR-146b-5p轉(zhuǎn)染至甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1中，細(xì)胞數(shù)都有所增加，但轉(zhuǎn)染組的TPC-1細(xì)胞增殖的更加明顯。（P<0.05）。
　　（2）CCK-8法和流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染miR-146b-5p基因后可以明顯促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1的增殖，實(shí)驗(yàn)組和對照組的TPC-1細(xì)胞數(shù)都有所增加

9、，但實(shí)驗(yàn)組的TPC-1細(xì)胞數(shù)增加更加顯著。（P<0.05）。
　?。?）流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率：實(shí)驗(yàn)組和空載組、對照組相比較細(xì)胞凋亡減少明顯，差異顯著。（P<0.05）。
　　（4）劃痕實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染miR-146b-5p后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-146b-5p中，24h、48h、72h遷移細(xì)胞數(shù)量均高于空載體組和對照組，轉(zhuǎn)染miR-146b-5p后TPC-1細(xì)胞的遷移細(xì)胞明顯增加（P<0.05）。transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)

10、觀察24h、48h、72h的穿膜細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染miR-146b-5p后TPC-1細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　經(jīng)過慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-146b-5p后，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞經(jīng)過CCK-8、劃痕實(shí)驗(yàn)、以及流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測：TPC-1細(xì)胞的增殖得到促進(jìn)，凋亡減少，遷移、侵襲能力明顯增強(qiáng)。提示在 TPC-1細(xì)胞中 miR-146b-5p與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展相關(guān)，miR-146b-5p的過表達(dá)可以促進(jìn) TPC