腦區(qū)硫銨素缺乏引發(fā)的軸突病變與阿爾茨海默病的病理機(jī)制的聯(lián)系.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)作為目前世界上最為常見的神經(jīng)退行性神經(jīng)疾病，具有發(fā)病率和致死率高的特點(diǎn)，因而逐漸成為重要的全球公共衛(wèi)生問題。AD的發(fā)病機(jī)制研究日益受到世界各國政府和廣大學(xué)者的高度重視，但目前為止其發(fā)病原因和機(jī)制仍是一個未解的謎團(tuán)。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)表明，軸突病變與阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，軸突病變的產(chǎn)生不僅早于AD的兩個特征性病理改變：即老年斑（senile plaqu

2、e，SP）和神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NTF），而且軸突漏的發(fā)現(xiàn)更被認(rèn)為是AD的重要發(fā)病機(jī)制之一。但是軸突病變是否與老年斑的產(chǎn)生沉積有所關(guān)聯(lián)卻不得而知。此外，如何解釋老年斑在腦區(qū)的沉積的位置有可能與AD的臨床表現(xiàn)不完全一致，這一問題也一直未完全闡明。因此，為了探討軸突病變與阿爾茨海默病老年斑產(chǎn)生的關(guān)系，我們選擇4個月野生型C57BL/6小鼠和同齡的經(jīng)過鑒定的 APP/PS1阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠，采用

3、在小鼠海馬齒狀回、內(nèi)嗅皮層及前皮質(zhì)腦區(qū)注射硫胺素拮抗劑吡啶硫胺(pyrithiamine)的方式誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞硫胺素缺乏(Thiamine Deficiency，TD)建立特定腦區(qū)神經(jīng)回路軸突病變動物模型。在TD處理前及TD處理后10天進(jìn)行動物認(rèn)知行為檢測，TD處理后30天應(yīng)用免疫熒光、神經(jīng)示蹤技術(shù)、Western-blot及RT-PCR觀察注射腦區(qū)及其投射回路腦區(qū)內(nèi)軸突的形態(tài)學(xué)、Aβ和過度磷酸化 tau蛋白表達(dá)的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TD處理

4、后APP/PS1小鼠和C57BL/6小鼠的主，被動規(guī)避行為與對照組相比有顯著下降（P<0.05）,TD處理后30天，兩種小鼠腦區(qū)內(nèi)過度磷酸化tau蛋白，Aβ呈現(xiàn)高表達(dá)，值得一提的是，我們不但發(fā)現(xiàn)吡啶硫胺注射的腦區(qū)內(nèi)呈現(xiàn)軸突病變改變包括軸突和軸突膨體腫脹以及“軸突漏”，而且注射腦區(qū)神經(jīng)元的投射腦區(qū)也發(fā)現(xiàn)有顯著的軸突病變，在 APP/PS1小鼠出現(xiàn)軸突病變的投射腦區(qū)還伴隨有斑塊形成。綜合上述結(jié)果提示：TD處理引起的軸突病變與AD的傳統(tǒng)病理發(fā)

5、生和發(fā)展的過程存在關(guān)聯(lián)，而病變神經(jīng)元投射腦區(qū)的軸突病變特別是軸突漏的改變可能是導(dǎo)老年斑沉積腦區(qū)與其功能改變和臨床表現(xiàn)不一致的主要原因。
　　第一部分APP/PS1小鼠的飼養(yǎng)與鑒定方法比較
　　方法：
　　1.分別挑選健康的成年APP/PS1小鼠20只和C57BL/6小鼠(以下簡稱WT小鼠)10只，按照♂APP/PS15只+♀C57BL/65只為組1和♀APP/PS15只+♂C57BL/65只為組2，♂APP/PS15只

6、+♀APP/PS15只為組3的方式分為3組，分別觀察3個月并記錄各組別母鼠的繁殖次數(shù)，小鼠產(chǎn)量及小鼠成活數(shù)量。
　　2.分別用血液基因組 DNA提取方法與組織基因組 DNA提取方法提取待鑒定的APP/PS1子代小鼠的DNA。
　　3.將兩種方法提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物分析，將兩種方法所得的陽性產(chǎn)物進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：
　　1.組1與組2和組3的子代產(chǎn)量和子代存活數(shù)量相比較 P<0.01，即采用♂APP/

7、PS1+♀C57BL/6的交配方式可以獲得更多更健康的子代小鼠。
　　2.相同條件下用組織基因組 DNA提取方法進(jìn)行鑒定其陽性率明顯高于用血液基因組DNA提取方法。
　　第二部分腦區(qū)TD處理模型的建立與動物行為學(xué)檢測
　　方法：
　　1.將APP/PS1小鼠及WT小鼠分組并稱重麻醉后,按照小鼠腦圖譜在右海馬齒狀回、右內(nèi)嗅皮層、右前皮質(zhì)立體定位注射 pyrithiamine（5μg／g體重）。注射后縫合皮膚，抗生素

8、抗感染治療后送入動物房觀察。
　　2．分別在小鼠TD處理前和TD處理后10天使用主、被動規(guī)避儀對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行主、被動規(guī)避實(shí)驗(yàn)檢測
　　結(jié)果：
　　1.主動規(guī)避實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：APP/PS1和WT小鼠條件反應(yīng)次數(shù)TD處理后較TD處理前降低非常明顯（P<0.01），而非條件反應(yīng)次數(shù)及無反應(yīng)次數(shù)TD處理后分別較TD處理前明顯增多（P<0.05，P<0.01）。
　　2.被動規(guī)避實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：APP/PS1小鼠和WT小鼠T

9、D處理后STL時間明顯縮短（P<0.01）。
　　第三部分腦區(qū)TD處理導(dǎo)致的軸突病變與AD病理機(jī)制的聯(lián)系
　　方法：
　　1.選擇右海馬齒狀回、右內(nèi)嗅皮層、右前皮質(zhì)分別注射神經(jīng)示蹤劑（BDA）。
　　2.分別選擇在TD處理后10天和30天對實(shí)驗(yàn)小鼠灌注取腦，進(jìn)行冰凍切片組織準(zhǔn)備。
　　3.用ABC染色法進(jìn)行冰凍切片的染色使神經(jīng)示蹤劑BDA顯色。
　　4.提取蛋白進(jìn)行Western blot，比較TD前

10、后各組小鼠腦內(nèi)Aβ含量的變化
　　5.提取各組小鼠腦組織RNA，運(yùn)用Real-TimePCR，檢測TD前后各組小鼠腦內(nèi)β-APP基因表達(dá)的變化。
　　6.免疫熒光雙標(biāo)檢測TD前后各組小鼠腦內(nèi)Aβ及AT8（過度磷酸化的tau蛋白）的表達(dá)
　　結(jié)果：
　　1.APP/PS1小鼠和WT小鼠TD處理后10天注射腦區(qū)可以出現(xiàn)輕微的軸突病變，表現(xiàn)為軸突輕度腫脹及部分膨體腫脹出現(xiàn)，APP/PS1小鼠和WT小鼠TD處理后30天注

11、射腦區(qū)及投射腦區(qū)均出現(xiàn)明顯的軸突病變，表現(xiàn)為軸突嚴(yán)重腫脹及膨體腫大，甚至有軸突漏出現(xiàn)。APP/PS1小鼠部分腦區(qū)可以看到老年斑出現(xiàn)。
　　2. Western blot顯示 APP/PS1小鼠和 WT小鼠 TD處理后 Aβ呈現(xiàn)高表達(dá)（P<0.01）。
　　3. Real-TimePCR檢測顯示APP/PS1小鼠和WT小鼠TD處理后30天β-APP基因表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01）。
　　4.免疫熒光顯示APP/PS1小鼠