應(yīng)用MALDI-TOF MS和液相懸浮芯片技術(shù)建立一種對(duì)沙門(mén)菌快速鑒定及血清型分型方法與廣州市腹瀉患者沙門(mén)菌耐藥表型和分子分型研究.pdf

1、沙門(mén)菌引起的感染性疾病是一個(gè)世界性的健康難題。沙門(mén)菌的感染主要來(lái)自于被污染的食物和水源，可以引起人類(lèi)和動(dòng)物多種疾病，輕者為自愈性胃腸炎，重者可引起致死性傷寒，其引起的疾病主要包括以下幾種:胃腸炎、菌血癥或敗血癥、傷寒和副傷寒。沙門(mén)菌引起的最常見(jiàn)的疾病是自愈性胃腸炎，其引起的發(fā)熱在2天之內(nèi)，而腹瀉的持續(xù)時(shí)間不超過(guò)7天。傷寒的典型癥狀是發(fā)熱、頭痛、腹瀉、腹痛并可引起呼吸系統(tǒng)、肝脾和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷等嚴(yán)重并發(fā)癥。
　　沙門(mén)菌為具有鞭毛的革

2、蘭陰性桿菌，其抗原結(jié)構(gòu)主要有3種，即菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原及表面抗原（Vi抗原等），當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)58種O抗原和114種H抗原。根據(jù)沙門(mén)菌的O抗原和H抗原的不同，參考Kauffmann-White分型方案，已有超過(guò)2500種血清型被發(fā)現(xiàn)。不同血清型的沙門(mén)菌引起的疾病類(lèi)型會(huì)有所不同，腸熱癥主要由傷寒沙門(mén)菌和副傷寒沙門(mén)菌引起，菌血癥或敗血癥則多數(shù)以豬霍亂沙門(mén)菌的感染為主。另外，在沙門(mén)菌引起的食源性疾病暴發(fā)流行中，往往由一種或某幾種血清型

3、的沙門(mén)菌引發(fā)的感染，可根據(jù)具體的血清型進(jìn)行溯源，及早發(fā)現(xiàn)疾病暴發(fā)流行的源頭，阻止其繼續(xù)傳播。因此，對(duì)沙門(mén)菌血清型進(jìn)行準(zhǔn)確快速分型，有助于臨床上對(duì)沙門(mén)菌病的診斷和治療，有助于沙門(mén)菌引起的爆發(fā)流行中的調(diào)查研究與控制，并且可用于監(jiān)控每種血清型的變化趨勢(shì)。
　　基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laserdesorption/ionization time of flight mass spectromet

4、ry, MALDI-TOF MS)是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)，主要是對(duì)微生物中的特異性核糖體蛋白進(jìn)行軟電離，形成特定的蛋白指紋圖譜，與已建立好的各種微生物的蛋白指紋圖譜庫(kù)進(jìn)行匹配，從而快速獲得鑒定結(jié)果。MALDI-TOF MS操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速準(zhǔn)確，并且具有高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于臨床微生物的病原診斷。
　　液相懸浮芯片技術(shù)是一種多功能的液相分析平臺(tái)，許多反應(yīng)均發(fā)生于懸浮于液相中的微球表面，因而得名，也被稱(chēng)為

5、xMAP(flexible multi-analyte profiling)、液相芯片或者懸浮陣列。xMAP將高通量的生物芯片技術(shù)，激光技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、及應(yīng)用流體學(xué)等技術(shù)結(jié)合在一起，是一種新型的高通量的芯片檢測(cè)平臺(tái)，利用懸浮在液相中的分類(lèi)編碼微球作為檢測(cè)載體，具有高通量、快速、靈敏度和特異性強(qiáng)及檢測(cè)范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。針對(duì)沙門(mén)氏菌的各種O和H抗原的目的基因片段設(shè)計(jì)特異性引物，并且設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)的特異探針，經(jīng)多重PCR后，偶聯(lián)有各種探針的微球與P

6、CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，然后進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，從而確定被檢測(cè)沙門(mén)菌相對(duì)應(yīng)的O和H抗原。美國(guó)Luminex公司最近開(kāi)發(fā)了Luminex xMAP(@)Salmonella Serotyping Assay(xMAP SSA)試劑盒，可以對(duì)沙門(mén)菌的血清型進(jìn)行快速鑒定。該試劑盒在國(guó)內(nèi)外的應(yīng)用尚處于探索階段，在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　本研究包括以下兩個(gè)部分:
　　一、應(yīng)用MALDI-TOF MS和液相懸浮芯片技術(shù)建立一種對(duì)沙門(mén)菌快速鑒

7、定及血清型分型方法
　　沙門(mén)菌的血清型鑒定長(zhǎng)期以來(lái)依靠傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，傳統(tǒng)的血清學(xué)方法需要生產(chǎn)上百種抗血清，并且這些抗血清的生產(chǎn)和使用過(guò)程均要進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS和液相懸浮芯片技術(shù)建立一種對(duì)沙門(mén)菌快速鑒定及血清型分型方法，并且評(píng)價(jià)該方法對(duì)沙門(mén)菌鑒定與血清型分型的效能，以及其在中國(guó)南方地區(qū)的應(yīng)用價(jià)值。收集205株來(lái)源于中國(guó)南方地區(qū)的沙門(mén)菌，利用微生物自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)—Vitek2和MALDI-TOF M

8、S在屬的水平上鑒定沙門(mén)菌，然后應(yīng)用液相懸浮芯片技術(shù)—xMAP SSA和傳統(tǒng)分型方法同時(shí)檢測(cè)沙門(mén)菌的血清型。對(duì)于xMAP SSA和傳統(tǒng)血清學(xué)方法檢測(cè)不一致血清型的結(jié)果，則對(duì)相關(guān)fljB基因和fliC基因進(jìn)行PCR和測(cè)序分析，進(jìn)一步判斷哪種方法檢測(cè)的結(jié)果是準(zhǔn)確的。MALDI-TOF MS在鑒定沙門(mén)菌菌屬時(shí)，與Vitek2的檢測(cè)結(jié)果完全一致，所有菌株均能準(zhǔn)確鑒定到沙門(mén)菌菌屬。Vitek2對(duì)每個(gè)沙門(mén)菌菌菌株的鑒定所消耗的時(shí)間平均需要5個(gè)小時(shí)，而

9、MALDI-TOF MS僅需要5分鐘左右的時(shí)間就可以輸出鑒定結(jié)果。MALDI-TOF MS可以直接鑒定生長(zhǎng)在選擇性平板上的沙門(mén)菌，而Vitek2卻不能。205株沙門(mén)菌中共有40種血清型，數(shù)量最多的前5種血清型分別為腸炎沙門(mén)菌(Enteritidis)(n=42，20.49％)，斯坦利沙門(mén)菌(Stanley)(n=32，15.61％)，Ⅰ4，5，12:i:-(n=29，14.15％)，鼠傷寒沙門(mén)菌（typhimurimum）(n=24，1

10、1.71％)、德?tīng)柋吧抽T(mén)菌(Derby)(n=9，4.39％)。對(duì)205株沙門(mén)菌血清型的鑒定中，195株沙門(mén)菌的血清型可以被xMAP SSA完全鑒定，有10(4.87％)個(gè)菌株的血清型部分的O抗原或者H抗原由于超出本方法的檢測(cè)范圍不能被完全鑒定，xMAP SSA準(zhǔn)確鑒定195株沙門(mén)菌中的192株沙門(mén)菌的血清型(98.5％，192/195)，其中僅錯(cuò)誤鑒定3株沙門(mén)菌的H抗原。傳統(tǒng)法對(duì)5個(gè)沒(méi)有動(dòng)力的沙門(mén)菌菌株和3個(gè)單相型沙門(mén)菌菌株均沒(méi)有完整

11、鑒定出其血清型，但是xMAP SSA可以鑒定出完整的血清型。xMAP SSA不需要相位誘導(dǎo)，且可以進(jìn)行自動(dòng)化大批量檢測(cè)。結(jié)合MALDI-TOF MS和xMAP SSA這兩種新發(fā)展的技術(shù)，從沙門(mén)菌菌屬的鑒定到血清型結(jié)果的檢測(cè)過(guò)程比常用的Vitek2結(jié)合傳統(tǒng)血清學(xué)方法平均可節(jié)約79個(gè)小時(shí)，前者檢測(cè)一個(gè)沙門(mén)菌菌株的血清型平均成本費(fèi)用只是Vitek2結(jié)合傳統(tǒng)血清學(xué)方法的1/3左右。MALDI-TOF MS結(jié)合x(chóng)MAP SSA鑒定沙門(mén)菌血清型的準(zhǔn)

12、確率高達(dá)98.5％。 MALDI-TOF結(jié)合x(chóng)MAP SSA的方法鑒定沙門(mén)菌血清型具有準(zhǔn)確，快速，高通量和低成本的優(yōu)點(diǎn)。該方法將會(huì)極大地增強(qiáng)臨床和公共衛(wèi)生健康部門(mén)對(duì)沙門(mén)菌血清型分型的能力，十分有助于本地區(qū)對(duì)沙門(mén)菌血清型快速鑒定和監(jiān)測(cè)，并且適用于中國(guó)南方地區(qū)。
　　二、2013年1月～2014年5月廣州市腹瀉患者沙門(mén)菌耐藥表型、PFGE和MALDI-TOF MS分型研究
　　沙門(mén)菌是引起食源性疾病的主要病原體之一，可以對(duì)人類(lèi)和

13、動(dòng)物致病。多年以來(lái)，在廣州市發(fā)生食物中毒的事件中，沙門(mén)菌一直占前四位?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time ofFlight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS)是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)，不僅應(yīng)用于細(xì)菌和真菌的快速鑒定，也逐漸探索其在細(xì)菌的種的水平上分型中的應(yīng)用。為了研究廣州市2013年1月～2014年

14、5月腹瀉患者感染的沙門(mén)菌的血清型分布、耐藥情況以及PFGE的分型特征，并且研究MALDI-TOFMS在沙門(mén)菌分型中的應(yīng)用，本研究利用傳統(tǒng)血清學(xué)方法鑒定沙門(mén)菌的血清型，用紙片擴(kuò)散法(KB法)進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。同時(shí)，對(duì)82株斯坦利沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌和Ⅰ4，5，12:i:-四種血清型的沙門(mén)菌，應(yīng)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)和MALDI-TOF MS進(jìn)行分型研究。從2013年1月至2014年5月，179株廣州市腹瀉患者沙門(mén)菌

15、的臨床分離株被鑒定為38種血清型，數(shù)量居前四位的血清型為腸炎沙門(mén)茵(21.2％)、斯坦利沙門(mén)菌(17.3％)、Ⅰ4，5，12:i:-沙門(mén)菌(16.2％)和鼠傷寒沙門(mén)菌(10.1％)。所有沙門(mén)菌菌株對(duì)萘啶酸、呋喃妥因、四環(huán)素、氨芐西林耐藥率最高，分別達(dá)到44.7％，42.5％，39.7％和35.8％，對(duì)環(huán)丙沙星的敏感率僅為20.7％;對(duì)頭孢他啶、頭孢噻肟和頭孢曲松的耐藥率均為7.3％，9.5％和9.5％，對(duì)頭孢吡肟的耐藥率為7.3％。對(duì)三

16、類(lèi)及以上抗生素耐藥的多重耐藥菌有72(40.2％)株。116株四種常見(jiàn)血清型斯坦利沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌和Ⅰ4，5，12:i:-沙門(mén)菌的多重耐藥菌株共有54株，占46.6％。傷寒沙門(mén)菌有2株，但是均沒(méi)有對(duì)環(huán)丙沙星和頭孢類(lèi)藥物表現(xiàn)耐藥。不同血清型的沙門(mén)菌表現(xiàn)出不同的耐藥情況。以相似度90％以上判定為同一型別，27株斯坦利沙門(mén)菌、21株腸炎沙門(mén)菌、21株鼠傷寒沙門(mén)菌和13株Ⅰ4，5，12:i:-沙門(mén)菌分別可分為13、10、11、1

17、0個(gè)PFGE型與26、20、21、13個(gè)MS型。以相似度100％為同一PFGE型，27株斯坦利沙門(mén)菌、21株腸炎沙門(mén)菌、21株鼠傷寒沙門(mén)菌和13株Ⅰ4，5，12:i:-沙門(mén)菌分別可分為25、15、17和13個(gè)PFGE型。從2013年至2014年，在廣州市年引起腹瀉的沙門(mén)菌主要以斯坦利沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌和Ⅰ4，5，12:i:-沙門(mén)菌為主，分成多種PFGE型，呈高度散發(fā)的態(tài)勢(shì)。本地區(qū)沙門(mén)菌菌株的多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，對(duì)于氟喹諾酮類(lèi)