基于CRISPR序列的沙門氏菌分子分型方法的建立.pdf

1、沙門氏菌（Salmonella）是引發(fā)食物中毒的主要食源性致病菌之一，其中腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）是全球范圍內(nèi)最重要的沙門氏菌血清型之一。開展沙門氏菌分子分型工作，能夠揭示菌株的來源、變異和進化規(guī)律，為沙門氏菌危害溯源、風(fēng)險評估和危害控制提供數(shù)據(jù)支撐，對追蹤和監(jiān)測致病菌的傳播和疫情暴發(fā)具有重要意義。
　　本研究以規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(Clustered

2、Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)為基礎(chǔ)，研究了CRISPR的結(jié)構(gòu)和功能及不同血清型CRISPR間隔序列差異，并基于快速、有效、成本低、簡單化的原則，提出了兩種新型的CRISPR分型方法即 CSST（CRISPR initial three Spacers Sequence Typing）和TCSST（Target and CRISPR initial thre

3、e Spacers Sequence Typing），將這兩種分型方法應(yīng)用于沙門氏菌分子分型實踐中，對其進行應(yīng)用評估。
　　本研究首先根據(jù) CRISPR1及 CRISPR2上下游保守序列分別設(shè)計了擴增不同沙門氏菌血清型的CRISPR1引物及 CRISPR2引物，至少可以應(yīng)用于30種沙門氏菌血清型的分子分型，并繪制了這30種CRISPR1與CRISPR2間隔序列圖譜。另外，從S9、S45、S69、S87、S95、S121、S165和

4、S200等8個沙門氏菌屬特異性靶點中篩選出了聚類分型效果最佳的S69，在有需要進一步提高分辨力時納入CSST分型體系中，構(gòu)建TCSST分子分型方法，作為對CSST分型缺陷的有力補充。
　　隨后，利用傳統(tǒng)CRISPR分型、S69分型、CSST及TCSST等四種分型方法分別對30種沙門氏菌血清型共86株菌進行分型探究，區(qū)分度（辛普森指數(shù)，D值）分別為0.9692、0.8902、0.9199和0.9423，說明四種方法對不同血清型沙門氏

5、菌都具有良好的分辨力，其中以傳統(tǒng) CRISPR分型最佳，TCSST次之。CSST分型至少可以將21種血清型分開，優(yōu)于S69分型，在將更多的血清型分開的同時對同種血清型的菌株也有一定的分辨力，如把傷寒沙門氏菌分成兩支，把鼠傷寒沙門氏菌分成3個分支，而且 CSST只需要分析 CRISPR1/CRISPR2的三個間隔序列，比傳統(tǒng)的CRISPR分型更加簡便，測序成本低，只需要上游序列即可，因此CSST可用于對不同沙門氏菌血清型的快速、有效的甄別

6、。
　　此外，本研究將毒力基因分型、ERIC-PCR分型、傳統(tǒng)CRISPR分型、CLSPT分型、CSST分型和TCSST分型等六種方法同時應(yīng)用于2008-2012年90株不同來源的腸炎沙門氏菌分離株的分型，分別可以得到7、1、6、1、4和12個基因型，D值分別為0.4092、0、0.1293、0、0.0871和0.7506，以TCSST法的分型效果最佳，將菌株數(shù)量增加到198株時，可分31個TCSST型，區(qū)分值為0.6555，對腸

7、炎沙門氏菌仍有一定應(yīng)用分型價值。而且，TCSST型與菌株的來源及年份有一定的相關(guān)性，同時探討了TCSST型與毒力基因的關(guān)系。另外，腸炎沙門氏菌分離株數(shù)目增加到198株時，可分為31個TCSST，區(qū)分度為0.6555，TCSST對腸炎沙門氏菌仍有一定的分辨力。
　　綜上，本研究 CSST分型方法在不同沙門氏菌血清型菌株分型應(yīng)用中具有較高的應(yīng)用價值，只需要分析部分間隔序列，因此具有操作簡便、成本低等優(yōu)點，同時納入特異性靶點S69后建立