DEHP致隱睪癥跨代遺傳的基因組印記修飾機制.pdf

1、背景：兒童時期泌尿生殖畸形中最常見的疾病便是隱睪（Cryptorchidism），足月生產(chǎn)男嬰中隱睪的發(fā)病率高達3％-4%，近些年研究提示在歐洲、美洲和我國部分工業(yè)發(fā)達的地區(qū)，泌尿生殖畸形包括隱睪的發(fā)生率明顯增加。越來越多證據(jù)表明隱睪癥的發(fā)生、發(fā)展與環(huán)境污染、機體內(nèi)分泌、家族遺傳等因素密切相關，環(huán)境因素的刺激和變化可能在其中起到主要的作用。隱睪癥能引起男性生殖功能障礙導致不育，睪丸癌變幾率也比正常睪丸增加了20-60倍。但是環(huán)境內(nèi)分泌因

2、子等究竟是通過什么途徑對機體造成的改變和影響目前還不能明確的闡述說明，因此，研究隱睪癥的發(fā)病機制具有十分重要的現(xiàn)實意義。
　　人類很早就認識到很多的人工合成化學污染物、添加劑通過干擾生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)從而影響泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能，這些因子廣泛存在于環(huán)境中，人類很容易接觸到它們，現(xiàn)已經(jīng)將這類物質統(tǒng)稱為環(huán)境內(nèi)分泌干擾因子（Environmental Endocrine Disruptors,EED）。鄰苯二甲酸二乙基己酯（Di(2-

3、Ethylhexyl) Phthalate，DEHP）是鄰苯二甲酸酯類化合物（phthalate esters，PAEs）中重要的一員，它已經(jīng)被證實為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。DEHP通稱塑化劑，在我國廣泛應用于各行各業(yè)，產(chǎn)耗量極大，大量用于塑料產(chǎn)品制造，最常見如食品包裝材料、醫(yī)用材料、玩具制造等。DEHP也是很多化工產(chǎn)品的重要組成成分，不易降解，長期存在于自然界，可以通過多種途徑對環(huán)境造成嚴重的“白色”污染，無形之中危害到人類身體健康。研究證

4、實：使親代（F0）孕期暴露于 DEHP，能誘導出子代（F1）隱睪癥發(fā)生，隱睪癥的發(fā)病率高達57％，病變睪丸體積明顯縮小，睪丸組織曲細精管發(fā)育不良，附睪組織管腔內(nèi)精子數(shù)量減少，生育能力下降明顯。親代（F0）孕期暴露DEHP雖然沒有造成F1代基因突變或者DNA序列改變，但是能導致F1代DNA甲基化修飾狀態(tài)的改變，具體表現(xiàn)：(1) F1代基因組DNA甲基化水平較正常對照組增高約10%；(2) DNA甲基化轉移酶的表達均有不同程度的增強，分別是

5、Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b。研究結果提示表觀遺傳學研究范疇的DNA甲基化修飾模式改變是DEHP導致F1代隱睪發(fā)生的機制之一。同時，在前期研究中觀察到：染毒孕鼠F0代所產(chǎn)F1代雄性仔鼠與正常雌鼠交配所生F2代雄性小鼠隱睪的發(fā)生率較正常對照組明顯升高，F(xiàn)2代雄性小鼠隱睪的發(fā)生率約為12.5%。
　　環(huán)境因素雖然沒有造成基因突變或者DNA序列改變，但是所引起的DNA甲基化修飾模式等表觀遺傳學改變卻能促使親代疾病的發(fā)生，更為重

6、要的是理論上這種“獲得性”表觀遺傳修飾改變可以通過生殖細胞（基因印記）遺傳給后代，導致子代疾病的發(fā)生。研究提示：環(huán)境污染源DEHP所致的“獲得性”隱睪能夠從F1代遺傳給F2代。然而，DEHP是如何通過DNA甲基化轉移酶影響基因組印記甲基化修飾模式的改變，從而抑制雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育關鍵基因的表達，誘導隱睪癥發(fā)生跨代遺傳？目前機制尚不明確，國內(nèi)外資料也未見報道。
　　本研究擬通過將DEHP于性腺發(fā)育的關鍵時期作用于孕鼠(F0)，研究F1

7、～F4代隱睪跨代遺傳的演變情況，篩選雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育過程中的關鍵性印記基因，以期探明基因組印記修飾在隱睪癥跨代遺傳發(fā)生、發(fā)展過程中的作用和機制，為科學有效干預阻斷隱睪癥的發(fā)生和未來生物制藥作用靶位點的選擇，提高國民人口素質，提供科學的實驗依據(jù)。本文的主要研究內(nèi)容及結果如下：
　　第一部分:“獲得性”隱睪癥跨代遺傳模型的建立
　　目的：親代孕期暴露DEHP誘導子代隱睪癥的發(fā)生，“獲得性”隱睪癥跨代遺傳模型建立。
　　方法

8、：
　　1.動物分組與給藥：妊娠SD大鼠隨機分為2組：正常對照組和DEHP實驗組,實驗組自妊娠第7d到19d持續(xù)經(jīng)口予以DEHP750mg/kg·d灌胃,觀察子代隱睪發(fā)生情況。
　　2.隱睪的發(fā)生情況和生殖系統(tǒng)的組織學檢查：觀察子代隱睪發(fā)生情況，雌鼠受孕率；記錄大鼠體重和睪丸、附睪重量以及AGD值，觀察精子數(shù)量和質量；觀察連續(xù)4代大鼠睪丸組織形態(tài)的演變情況。
　　3.胰島素樣因子3、睪酮（T）表達的檢測。
　　結

9、果：
　　1.成功建立隱睪癥跨代遺傳模型，F(xiàn)1代隱睪發(fā)生率為30%，F(xiàn)2代隱睪發(fā)生率為12.5%，F(xiàn)3、F4代未見隱睪發(fā)生。
　　2.交配實驗顯示F1代使雌鼠受孕率為50%，F(xiàn)2代為75%，F(xiàn)3、F4代100%；HE染色發(fā)現(xiàn)F1代睪丸生精上皮明顯萎縮，生精細胞少，F(xiàn)2代有所改善，F(xiàn)3、F4代形態(tài)趨于正常。
　　3.胰島素樣因子3、睪酮表達在F1代明顯減少。
　　第二部分:“獲得性”隱睪癥基因組印記機制研究

10、　　目的：探討基因組甲基化狀態(tài)改變和基因組印記甲基化修飾差異是否為“獲得性”隱睪癥發(fā)生跨代遺傳的機制？
　　方法：
　　1.Real-Time PCR和Western Blot檢測DNA甲基化轉移酶mRNA和蛋白質的表達
　　2.甲基化測序檢測基因組甲基化水平和CpG甲基化差異檢測
　　3.印記基因篩選和鑒定
　　結果：
　　1.Real Time-PCR、免疫組化和Western Blot表明DNA

11、甲基化轉移酶的表達是一個動態(tài)變化的過程，在F1代表達水平明顯增加，隨著傳代數(shù)增加，表達水平逐漸降低，至F4代與正常對照組無明顯差異。
　　2.全基因組甲基化測序提示F1代與F4代及正常對照組的甲基化水平有著明顯的差別。
　　3.FGF9、RN5-8S基因啟動子區(qū)甲基化差異明顯與隱睪癥的發(fā)生相關。
　　結論：DEHP導致大鼠雄性生殖功能受損，且損傷程度隨著遺傳代數(shù)的增加逐漸減弱。這可能是由于甲基化轉移酶表達受到調(diào)控繼而導