DEHP致隱睪癥跨代遺傳的基因組印記修飾機(jī)制.pdf

1、背景：兒童時(shí)期泌尿生殖畸形中最常見(jiàn)的疾病便是隱睪（Cryptorchidism），足月生產(chǎn)男嬰中隱睪的發(fā)病率高達(dá)3％-4%，近些年研究提示在歐洲、美洲和我國(guó)部分工業(yè)發(fā)達(dá)的地區(qū)，泌尿生殖畸形包括隱睪的發(fā)生率明顯增加。越來(lái)越多證據(jù)表明隱睪癥的發(fā)生、發(fā)展與環(huán)境污染、機(jī)體內(nèi)分泌、家族遺傳等因素密切相關(guān)，環(huán)境因素的刺激和變化可能在其中起到主要的作用。隱睪癥能引起男性生殖功能障礙導(dǎo)致不育，睪丸癌變幾率也比正常睪丸增加了20-60倍。但是環(huán)境內(nèi)分泌因

2、子等究竟是通過(guò)什么途徑對(duì)機(jī)體造成的改變和影響目前還不能明確的闡述說(shuō)明，因此，研究隱睪癥的發(fā)病機(jī)制具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　人類很早就認(rèn)識(shí)到很多的人工合成化學(xué)污染物、添加劑通過(guò)干擾生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)從而影響泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能，這些因子廣泛存在于環(huán)境中，人類很容易接觸到它們，現(xiàn)已經(jīng)將這類物質(zhì)統(tǒng)稱為環(huán)境內(nèi)分泌干擾因子（Environmental Endocrine Disruptors,EED）。鄰苯二甲酸二乙基己酯（Di(2-

3、Ethylhexyl) Phthalate，DEHP）是鄰苯二甲酸酯類化合物（phthalate esters，PAEs）中重要的一員，它已經(jīng)被證實(shí)為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。DEHP通稱塑化劑，在我國(guó)廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，產(chǎn)耗量極大，大量用于塑料產(chǎn)品制造，最常見(jiàn)如食品包裝材料、醫(yī)用材料、玩具制造等。DEHP也是很多化工產(chǎn)品的重要組成成分，不易降解，長(zhǎng)期存在于自然界，可以通過(guò)多種途徑對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的“白色”污染，無(wú)形之中危害到人類身體健康。研究證

4、實(shí)：使親代（F0）孕期暴露于 DEHP，能誘導(dǎo)出子代（F1）隱睪癥發(fā)生，隱睪癥的發(fā)病率高達(dá)57％，病變睪丸體積明顯縮小，睪丸組織曲細(xì)精管發(fā)育不良，附睪組織管腔內(nèi)精子數(shù)量減少，生育能力下降明顯。親代（F0）孕期暴露DEHP雖然沒(méi)有造成F1代基因突變或者DNA序列改變，但是能導(dǎo)致F1代DNA甲基化修飾狀態(tài)的改變，具體表現(xiàn)：(1) F1代基因組DNA甲基化水平較正常對(duì)照組增高約10%；(2) DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)均有不同程度的增強(qiáng)，分別是

5、Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b。研究結(jié)果提示表觀遺傳學(xué)研究范疇的DNA甲基化修飾模式改變是DEHP導(dǎo)致F1代隱睪發(fā)生的機(jī)制之一。同時(shí)，在前期研究中觀察到：染毒孕鼠F0代所產(chǎn)F1代雄性仔鼠與正常雌鼠交配所生F2代雄性小鼠隱睪的發(fā)生率較正常對(duì)照組明顯升高，F(xiàn)2代雄性小鼠隱睪的發(fā)生率約為12.5%。
　　環(huán)境因素雖然沒(méi)有造成基因突變或者DNA序列改變，但是所引起的DNA甲基化修飾模式等表觀遺傳學(xué)改變卻能促使親代疾病的發(fā)生，更為重

6、要的是理論上這種“獲得性”表觀遺傳修飾改變可以通過(guò)生殖細(xì)胞（基因印記）遺傳給后代，導(dǎo)致子代疾病的發(fā)生。研究提示：環(huán)境污染源DEHP所致的“獲得性”隱睪能夠從F1代遺傳給F2代。然而，DEHP是如何通過(guò)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶影響基因組印記甲基化修飾模式的改變，從而抑制雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)，誘導(dǎo)隱睪癥發(fā)生跨代遺傳？目前機(jī)制尚不明確，國(guó)內(nèi)外資料也未見(jiàn)報(bào)道。
　　本研究擬通過(guò)將DEHP于性腺發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期作用于孕鼠(F0)，研究F1

7、～F4代隱睪跨代遺傳的演變情況，篩選雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵性印記基因，以期探明基因組印記修飾在隱睪癥跨代遺傳發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用和機(jī)制，為科學(xué)有效干預(yù)阻斷隱睪癥的發(fā)生和未來(lái)生物制藥作用靶位點(diǎn)的選擇，提高國(guó)民人口素質(zhì)，提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　第一部分:“獲得性”隱睪癥跨代遺傳模型的建立
　　目的：親代孕期暴露DEHP誘導(dǎo)子代隱睪癥的發(fā)生，“獲得性”隱睪癥跨代遺傳模型建立。
　　方法

8、：
　　1.動(dòng)物分組與給藥：妊娠SD大鼠隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組和DEHP實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組自妊娠第7d到19d持續(xù)經(jīng)口予以DEHP750mg/kg·d灌胃,觀察子代隱睪發(fā)生情況。
　　2.隱睪的發(fā)生情況和生殖系統(tǒng)的組織學(xué)檢查：觀察子代隱睪發(fā)生情況，雌鼠受孕率；記錄大鼠體重和睪丸、附睪重量以及AGD值，觀察精子數(shù)量和質(zhì)量；觀察連續(xù)4代大鼠睪丸組織形態(tài)的演變情況。
　　3.胰島素樣因子3、睪酮（T）表達(dá)的檢測(cè)。
　　結(jié)

9、果：
　　1.成功建立隱睪癥跨代遺傳模型，F(xiàn)1代隱睪發(fā)生率為30%，F(xiàn)2代隱睪發(fā)生率為12.5%，F(xiàn)3、F4代未見(jiàn)隱睪發(fā)生。
　　2.交配實(shí)驗(yàn)顯示F1代使雌鼠受孕率為50%，F(xiàn)2代為75%，F(xiàn)3、F4代100%；HE染色發(fā)現(xiàn)F1代睪丸生精上皮明顯萎縮，生精細(xì)胞少，F(xiàn)2代有所改善，F(xiàn)3、F4代形態(tài)趨于正常。
　　3.胰島素樣因子3、睪酮表達(dá)在F1代明顯減少。
　　第二部分:“獲得性”隱睪癥基因組印記機(jī)制研究

10、　　目的：探討基因組甲基化狀態(tài)改變和基因組印記甲基化修飾差異是否為“獲得性”隱睪癥發(fā)生跨代遺傳的機(jī)制？
　　方法：
　　1.Real-Time PCR和Western Blot檢測(cè)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)
　　2.甲基化測(cè)序檢測(cè)基因組甲基化水平和CpG甲基化差異檢測(cè)
　　3.印記基因篩選和鑒定
　　結(jié)果：
　　1.Real Time-PCR、免疫組化和Western Blot表明DNA

11、甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，在F1代表達(dá)水平明顯增加，隨著傳代數(shù)增加，表達(dá)水平逐漸降低，至F4代與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　2.全基因組甲基化測(cè)序提示F1代與F4代及正常對(duì)照組的甲基化水平有著明顯的差別。
　　3.FGF9、RN5-8S基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化差異明顯與隱睪癥的發(fā)生相關(guān)。
　　結(jié)論：DEHP導(dǎo)致大鼠雄性生殖功能受損，且損傷程度隨著遺傳代數(shù)的增加逐漸減弱。這可能是由于甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)受到調(diào)控繼而導(dǎo)