DNA甲基化在低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓中的作用.pdf

1、背景：低氧性肺動(dòng)脈高壓的肺血管重構(gòu)和右心重構(gòu)在復(fù)氧后可發(fā)生顯著的逆轉(zhuǎn)，但其機(jī)制不明。DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控的重要機(jī)制。在外界刺激下，細(xì)胞的 DNA甲基化可發(fā)生動(dòng)態(tài)改變，調(diào)控基因表達(dá)，參與各種病理生理過(guò)程。DNA甲基化主要受 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族（DNMTs）的調(diào)控，已有研究指出 DNMTs在血管性疾病及腫瘤中均發(fā)揮重要作用，但其在肺動(dòng)脈高壓中的研究甚少。
　　目的：本研究旨在構(gòu)建低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型和復(fù)氧后肺動(dòng)脈高壓逆

2、轉(zhuǎn)模型，并探討 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白在肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)和右心重構(gòu)及其逆轉(zhuǎn)后的表達(dá)變化和潛在作用。
　　方法：將大鼠置于低壓氧艙內(nèi)，持續(xù)飼養(yǎng)3周，構(gòu)建低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型。低氧模型構(gòu)建成功后，將大鼠轉(zhuǎn)入正常外界環(huán)境，持續(xù)飼養(yǎng)6周，構(gòu)建低氧后復(fù)氧的肺動(dòng)脈高壓逆轉(zhuǎn)大鼠模型。在缺氧和復(fù)氧的連續(xù)時(shí)間點(diǎn)上，利用超聲心動(dòng)圖、右心導(dǎo)管檢查和組織病理學(xué)檢查來(lái)鑒定其表型。利用 Western blot、免疫組化等方法檢測(cè)正常對(duì)照組、低氧3

3、周組和復(fù)氧3周組大鼠肺組織和右心組織中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.持續(xù)低氧構(gòu)建的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的鑒定。持續(xù)低氧處理后，大鼠肺動(dòng)脈加速時(shí)間（PAAT）逐漸下降。低氧3周組大鼠的 PAAT（ n=8，14.4±1.8ms）降至正常對(duì)照組（ n=6，33.4±3.7ms）的43％。持續(xù)低氧處理后，大鼠右心室游離壁厚度（RVWT）、肺動(dòng)脈平均壓（mPAP）、右心室收縮

4、壓（RVSP）和右心室肥厚指數(shù)（RV/LV+S）均逐漸升高，低氧3周組大鼠的 RVWT（ n=8，1.04±0.26mm）升高至正常對(duì)照組（n=6，0.70±0.14mm）的1.5倍。低氧3周組大鼠的 mPAP（n=8，31.68±5.67mmHg）升至正常對(duì)照組（ n=6，14.63±2.39mmHg）的2.2倍，低氧3周組大鼠的RVSP（n=8，47.86±5.54mmHg）升至正常對(duì)照組（n=6，23.33±1.90mmHg）的2

5、.1倍。RV/LV+S在低氧3周組（ n=8，0.412±0.08）大鼠中升高至正常對(duì)照組（ n=6，0.225±0.021）的1.8倍。病理染色顯示，在低氧3周組大鼠出現(xiàn)明顯肺動(dòng)脈重塑和右心重構(gòu)。低氧3周組大鼠的肺小動(dòng)脈血管壁厚度百分比（WT%）（n=3，0.42±0.02%）為正常對(duì)照組（n=3，0.23±0.04%）的1.8倍，低氧3周組大鼠的肺小動(dòng)脈血管壁面積百分比（WA%）（n=3，0.72±0.08%）為正常對(duì)照組（n=3，

6、0.49±0.11%）的1.5倍。
　　2.低氧后復(fù)氧的肺動(dòng)脈高壓逆轉(zhuǎn)大鼠模型的鑒定。低氧后復(fù)氧處理的大鼠 PAAT逐漸升高。復(fù)氧6周組大鼠的 PAAT（n=8，23.2±3.7ms）升高至低氧3周組（n=8，14.4±1.8ms）的1.6倍，但復(fù)氧6周組大鼠的 PAAT仍低于正常對(duì)照組（ n=6，33.4±3.7ms）水平。而低氧后復(fù)氧處理的大鼠的 RVWT、mPAP、RVSP和 RV/LV+S逐漸下降。復(fù)氧3周組（n=8）大鼠

7、的 RVWT降至0.65±0.05mm，與正常對(duì)照組（ n=6，0.70±0.14ms）之間無(wú)差異。復(fù)氧6周組大鼠的 mPAP（n=8，19.25±3.54mmHg）與正常對(duì)照組（n=6，14.63±2.39mmHg）之間無(wú)差異，但仍高于正常對(duì)照組（n=6，23.33±1.90mmHg）。復(fù)氧3周組（ n=8）大鼠的 RV/LV+S下降至0.248±0.070，與正常對(duì)照組（ n=6，0.225±0.021）和復(fù)氧6周組（n=8，0.2

8、53±0.034）之間均無(wú)差異。病理染色也提示復(fù)氧3周后右心重構(gòu)完全逆轉(zhuǎn)，而大鼠肺血管重塑并未完全逆轉(zhuǎn)。相對(duì)于低氧3周組大鼠的WT%，復(fù)氧3周組（n=3，0.32±0.05%）大鼠的WT%下降了24%，但復(fù)氧3周組大鼠的 WT%仍高于正常對(duì)照組。復(fù)氧3周組（ n=3）大鼠的 WA%（0.54±0.08%）下降至低氧3周組的75%，但與正常對(duì)照組之間并無(wú)差異。
　　3. DNMTs在正常對(duì)照組、低氧3周組和復(fù)氧3周組肺組織的表達(dá)情況

9、。Dnmt1和 Dnmt3a蛋白在3組大鼠肺組織中的表達(dá)無(wú)差異。Dnmt3b蛋白在低氧3周組大鼠和復(fù)氧3周組大鼠肺組織的表達(dá)量均是正常對(duì)照組的3倍，而在低氧3周組大鼠和復(fù)氧3周組大鼠肺組織的表達(dá)無(wú)差異。Dnmt3L蛋白在低氧3周組大鼠肺組織中的表達(dá)水平下降至正常對(duì)照組的59%，復(fù)氧3周組大鼠肺組織中Dnmt3L蛋白表達(dá)水平是低氧3周組的3倍，與正常對(duì)照組相比無(wú)差異。
　　肺組織的免疫組化結(jié)果顯示，Dnmt3b蛋白主要表達(dá)于肌化的肺

10、血管和支氣管平滑肌。Dnmt3b蛋白在低氧3周組大鼠肺組織中表達(dá)明顯升高，而在復(fù)氧3周組大鼠肺組織中表達(dá)下降。
　　4. DNMTs在正常對(duì)照組、低氧3周和復(fù)氧3周組右心組織的表達(dá)情況。Dnmt1和 Dnmt3L在3組大鼠右心組織的表達(dá)無(wú)差異。Dnmt3a蛋白在低氧3周組大鼠右心組織的表達(dá)水平與正常對(duì)照組之間無(wú)差異，而復(fù)氧3周組大鼠右心組織中Dnmt3a蛋白的表達(dá)量較低氧3周組下降40%。Dnmt3b蛋白在低氧3周組大鼠右心組織的

11、表達(dá)是正常對(duì)照組的1.88倍，復(fù)氧3周組大鼠右心組織的表達(dá)量較低氧3周組下降41%，與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1.連續(xù)低氧3周大鼠的肺動(dòng)脈平均壓和右心室肥厚指數(shù)均升高2倍，提示低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型構(gòu)建成功；
　　2.復(fù)氧3周后大鼠的肺血管重塑和右心重構(gòu)均發(fā)生了部分或完全逆轉(zhuǎn)；
　　3. DNMTs家族中Dnmt3b在低氧誘導(dǎo)的肺血管重塑和右心重構(gòu)中均顯著升高，提示Dnmt3b可能在肺血管重塑和