LOX-1在低氧誘導(dǎo)肺動脈高壓肺血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制.pdf

1、第一章 LOX-1介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)肺動脈高壓肺血管重構(gòu)
　　研究背景: 肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)表現(xiàn)為靜息時(shí)平均肺動脈壓大于25 mmHg或運(yùn)動時(shí)大于30 mmHg，肺血管阻力大于3 Wood單位。
　　PAH的主要病因是肺小動脈原發(fā)病變而導(dǎo)致肺動脈阻力增加，最終可導(dǎo)致患者右心衰竭而死亡。業(yè)已證明，PAH時(shí)肺動脈阻力增高的主要原因是肺血管重構(gòu)導(dǎo)致肺動脈腔隙狹窄，而肺動脈

2、平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)的過度增殖是引起血管重構(gòu)的關(guān)鍵因素。
　　凝集素樣氧化性低密度脂蛋白受體-1（lectin-like oxidized lowdensity lipoprotein recepter-1，LOX-1）在多種心血管疾?。ò▌用}粥樣硬化和高血壓心血管重構(gòu)）的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用。LOX-1通過氧化應(yīng)激和促炎機(jī)制損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，

3、促進(jìn)心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖從而介導(dǎo)心臟、胸主動脈和腎血管重構(gòu)。最新研究發(fā)現(xiàn)，LOX-1在培養(yǎng)的慢性栓塞性肺動脈高壓患者PASMCs中表達(dá)增加，可能介導(dǎo)C反應(yīng)蛋白所誘導(dǎo)的PASMCs增殖。但LOX-1在低氧PAH血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制目前仍不清楚。因此，本研究擬在低氧誘導(dǎo)的PAH大鼠模型及原代PASMCs模型，探討LOX-1是否介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)PAH肺血管重構(gòu)，并進(jìn)一步探討該作用是否與其促PASMCs增殖有關(guān)。
　　方法: (1)

4、在體實(shí)驗(yàn):180～220 g SD大鼠，采用低氧倉(10％ O2)飼養(yǎng)3周誘導(dǎo)低氧PAH大鼠模型。右頸外靜脈插管測定右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動脈壓(mPAP)。分離右心室(RV)、左心室加室間隔(LV+IS)并稱重，計(jì)算RV/(LV+IS)比值。ELISA法檢測大鼠血漿中sLOX-1水平;提取肺動脈總RNA或蛋白，real-time PCR或Western Blot檢測LOX-1、Ki-67、PCNA mRNA或蛋白表達(dá);4％多

5、聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色或LOX-1免疫組化染色。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):大鼠原代PASMCs采用組織塊貼壁法制備，取第3代細(xì)胞進(jìn)行α-actin免疫組化鑒定細(xì)胞。3-6代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。低氧(3％O2)刺激細(xì)胞增殖。(3) LOX-1中和抗體實(shí)驗(yàn):采用不同濃度LOX-1中和抗體(5、10、20 ng/ml)預(yù)孵育1h，real-time PCR或Western Blot檢測LOX-1、Ki-67、PCNA mRNA或蛋白表達(dá)，流

6、式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，MTS檢測細(xì)胞增殖情況。(4) LOX-1小分子RNA干擾(siRNA)實(shí)驗(yàn):當(dāng)PASMCs達(dá)到60％～70％融合后，采用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑將LOX-1 siRNA干擾片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，干擾LOX-1表達(dá)，real-time PCR或Western Blot檢測LOX-1 mRNA或蛋白表達(dá)變化評價(jià)不同片段的干擾效率，選擇最佳干擾片段及適當(dāng)?shù)臐舛扔糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)。LOX-1 siRNA干擾24 h后低氧處理細(xì)胞

7、。Real-Time PCR或Western Blot檢測Ki-67，PCNA mRNA或蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，MTS檢測細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果: 1.低氧誘導(dǎo)PAH大鼠的RVSP、mPAP較常氧對照組顯著升高，RV/(LV+IS)顯著增加，右心室明顯增厚，肺動脈顯著重構(gòu)， Ki-67及PCNA mRNA表達(dá)顯著增加。2.低氧誘導(dǎo)PAH大鼠血漿中sLOX-1水平顯著高于常氧對照組;PAH肺動脈主干部位LOX-1mRN

8、A和蛋白表達(dá)顯著增加;免疫組化顯示肺小動脈LOX-1蛋白表達(dá)也顯著增加。3.低氧可促進(jìn)PASMCs增殖，同時(shí)可誘導(dǎo)LOX-1表達(dá);LOX-1中和抗體(TS-20)及LOX-1 siRNA可顯著抑制低氧引起的細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論: LOX-1介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖，參與低氧肺動脈高壓肺血管重構(gòu)。
　　第二章低氧促肺動脈平滑肌細(xì)胞中LOX-1表達(dá)上調(diào)的上游機(jī)制
　　研究背景: LOX-1是一種多配體受體，許多因

9、素可以導(dǎo)致LOX-1表達(dá)上調(diào)。我們第一章研究發(fā)現(xiàn)在低氧PAH時(shí)，低氧可顯著上調(diào)PASMCs中LOX-1表達(dá)。但是具體機(jī)制仍不清楚。
　　最新研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-let-7g可抑制其靶基因LOX-1的表達(dá)。于是，我們推測低氧上調(diào)LOX-1表達(dá)也許通過下調(diào)let-7g表達(dá)而引起。LOX-1激活后可促進(jìn)下游靶基因OCT-1與let-7g的啟動子區(qū)域結(jié)合。OCT-1是一個(gè)翻譯抑制因子，可以和let-7g啟動子區(qū)域靶向結(jié)合后抑制le

10、t-7g的表達(dá)。因此，我們推測LOX-1可能通過上調(diào)OCT-1進(jìn)而抑制let-7g的表達(dá)從而進(jìn)一步上調(diào)LOX-1本身的表達(dá)水平。
　　Calpain是一種非溶酶體Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶，可以被Ca2+信號途徑激活，并選擇性地解阮靶蛋白從而控制細(xì)胞功能如細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞周期生長、基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡。最新研究表明，calpain抑制劑MDL287170可明顯抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠PAH時(shí)肺血管重構(gòu)。已知LOX-1可通過激活細(xì)胞

11、內(nèi)Ca2+從而上調(diào)PKC的表達(dá)，進(jìn)一步上調(diào)OCT-1的表達(dá)。同時(shí)，calpain也可通過部分解阮作用導(dǎo)致靶蛋白PKC激活。因此，我們推測低氧PAH時(shí)，LOX-1可能通過LOX-1-calpains-PKC-OCT-1-let-7g-LOX-1途徑來實(shí)現(xiàn)反饋調(diào)節(jié)。
　　方法: (1)在體實(shí)驗(yàn):180～220 g SD大鼠，采用低氧倉(10％ O2)飼養(yǎng)3周誘導(dǎo)低氧PAH大鼠模型。右頸外靜脈插管測定右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動脈

12、壓(mPAP)。分離右心室(RV)、左心室加室間隔(LV+IS)并稱重，計(jì)算RV/(LV+IS)比值，以確定造模成功。提取肺動脈總RNA或蛋白，real-time PCR或Western Blot檢測LOX-1、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1、let-7g mRNA或蛋白的表達(dá);(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):大鼠原代PASMCs采用組織塊貼壁法制備，取第3代細(xì)胞進(jìn)行α-actin免疫組化鑒定細(xì)胞。3-6代用于后

13、續(xù)實(shí)驗(yàn)。低氧(3％O2)刺激細(xì)胞增殖;(3) Let-7g過表達(dá)實(shí)驗(yàn):采用let-7g mimic瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法。當(dāng)PASMCs達(dá)到70％～80％融合后，采用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑分別將let-7g mimic瞬時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞。Real-TimePCR檢測let-7g mRNA表達(dá)以確定轉(zhuǎn)染效率，選擇最佳濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。PASMCs轉(zhuǎn)染let-7g mimic24 h后低氧處理，real-time PCR或Western Blot檢測LO

14、X-1、Ki-67、PCNA mRNA或蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，MTS檢測細(xì)胞增殖情況;(4) PKC、LOX-1抑制實(shí)驗(yàn):采用不同濃度LOX-1中和抗體(5、10、20 ng/ml)或PKC抑制劑白屈菜紅堿(1μM)預(yù)孵育PASMCs1 h后低氧處理，real-timePCR或Western Blot檢測LOX-1、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1、let-7gmRNA或蛋白表達(dá);(5)

15、 LOX-1、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1抑制實(shí)驗(yàn):采用小分子RNA干擾(siRNA)法。當(dāng)PASMCs達(dá)到60％～70％融合后，采用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑分別將以上基因的siRNA干擾片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，干擾相應(yīng)基因表達(dá)， real-Time PCR或Western Blot檢測相應(yīng)基因mRNA或蛋白表達(dá)變化評價(jià)不同片段的轉(zhuǎn)染效率，選擇最佳干擾片段及適當(dāng)濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。siRNAs干擾24

16、 h后低氧處理細(xì)胞，real-time PCR或Western Blot檢測LOX-1、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1、let-7g mRNA或蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果: 1.低氧誘導(dǎo)PAH大鼠肺動脈及低氧誘導(dǎo)PASMCs中l(wèi)et-7gmRNA表達(dá)顯著降低，let-7g mimic可顯著降低低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖，同時(shí)也可顯著抑制低氧誘導(dǎo)的LOX-1表達(dá)上調(diào);2.抑制LOX-1可顯著逆轉(zhuǎn)低氧

17、引起的let-7g表達(dá)下調(diào)，LOX-1與let-7g之間存在著反饋調(diào)節(jié);3.低氧誘導(dǎo)PAH大鼠肺動脈及低氧誘導(dǎo)PASMCs中calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1表達(dá)顯著增加，抑制PKC、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1表達(dá)后可顯著逆轉(zhuǎn)低氧引起的let-7g表達(dá)下調(diào)及LOX-1表達(dá)上調(diào);4.抑制LOX-1表達(dá)后可抑制低氧引起的calpain-1、calpain-2、c

18、alpain-4、OCT-1表達(dá)上調(diào)，這些基因均參與了LOX-1-let-7g的反饋調(diào)節(jié)。
　　[結(jié)論]低氧PAH時(shí)，低氧引起PASMCs中LOX-1表達(dá)上調(diào)的上游機(jī)制為LOX-1-calpains-PKC-OCT-1-let-7g-LOX-1反饋調(diào)節(jié)通路。
　　第三章低氧肺動脈高壓時(shí)LOX-1促肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的下游機(jī)制
　　研究背景: 血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，V

19、SMCs)表型具有多樣性和可變性的特點(diǎn)。在胚胎發(fā)育過程中，VSMCs由未分化表型逐漸分化為具有成年特征的分化表型。當(dāng)血管受到損傷或體外培養(yǎng)的VSMCs受到生長因子刺激時(shí)，VSMCs又從分化型轉(zhuǎn)化為去分化型，表現(xiàn)為平滑肌標(biāo)志基因表達(dá)下調(diào)，合成和分泌能力增強(qiáng)，重新獲得增殖和遷移能力，導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄、血管順應(yīng)性降低和血管重構(gòu)等。大多數(shù)平滑肌標(biāo)志基因中存在一系列稱為CArG盒的順式調(diào)控元件。研究證明，CArG盒元件與血清反應(yīng)因子(se

20、rumresponse factor，SRF)的結(jié)合對許多心肌、血管平滑肌和骨骼肌特異表達(dá)基因起重要的調(diào)節(jié)作用。但同時(shí)CArG序列作為血清反應(yīng)元件(serum response element，SRE)的核心成分也是許多即刻早期反應(yīng)基因（如c-fos和egr-1）表達(dá)所必須的順式元件。因此，SRF除可激活平滑肌特異性基因外，還與細(xì)胞增殖有關(guān)。
　　有研究發(fā)現(xiàn)，兩條主要的信號通路可導(dǎo)致共轉(zhuǎn)錄因子和SRF結(jié)合而發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用。經(jīng)

21、典的通路是生長因子刺激使MAPK信號通路激活后導(dǎo)致SRF共轉(zhuǎn)錄因子Elk的磷酸化，最后導(dǎo)致細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。第二條調(diào)節(jié)通路是由Rho依賴性的肌動蛋白動態(tài)改變。研究表明，通過生長因子刺激可以抑制VSMCs分化，并且同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)由于生長因子依賴性的三元復(fù)合體因子(ternarycomplex factors，TCFs)存在，使myocardin從SRF中脫離出來。血管損傷或細(xì)胞增殖時(shí)，Elk可作為一個(gè)使myocardin從SRF中置換

22、出來的VSMCs特異基因表達(dá)的信號抑制因子。因此，VSMCs增殖可通過以下兩條途徑實(shí)現(xiàn):一條是通過MAPK通路導(dǎo)致TCF的磷酸化，而另一條是依賴于抑制MRTFs家族與SRF結(jié)合。
　　如前所述，LOX-1可促進(jìn)VSMCs和PASMCs增殖，但其促PASMCs增殖的機(jī)制尚不清楚。已知LOX-1激活后可導(dǎo)致下游通路的激活，其中包括:NADPH氧化酶、MAPKs(p38，ERK1/2，JNK)、PKC等。于是，我們推測在低氧刺激PASM

23、Cs時(shí)，LOX-1可能也通過激活MAPK通路中ERK1/2通路進(jìn)一步導(dǎo)致pElk表達(dá)增加，pElk與SRF結(jié)合增多而導(dǎo)致c-fos表達(dá)增加;同時(shí)pElk可能也通過抑制MRTF-A信號通路從而使PASMCs從分化型向增殖型轉(zhuǎn)化。我們假設(shè)，低氧PAH時(shí)LOX-1可能通過LOX-1-ERK1/2-pElk/MRTF-A-SRF-c-fos通路促進(jìn)PASMCs增殖。
　　方法: (1)在體實(shí)驗(yàn):180～220 g SD大鼠，采用低氧倉(1

24、0％ O2)飼養(yǎng)3周誘導(dǎo)低氧PAH大鼠模型。右頸外靜脈插管測定右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動脈壓(mPAP)。分離右心室(RV)、左心室加室間隔(LV+IS)并稱重，計(jì)算RV/(LV+IS)比值，以確定造模成功。提取肺動脈總RNA或蛋白，real-time PCR或Western Blot檢測pERK1/2、pElk、MRTF-A、SRF、c-fos、α-SMA mRNA或蛋白的表達(dá);4％多聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋，MRTF-A免

25、疫組化染色。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):大鼠原代PASMCs采用組織塊貼壁法制備，取第3代細(xì)胞進(jìn)行α-actin免疫組化鑒定細(xì)胞。3-6代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。低氧(3％O2)刺激細(xì)胞增殖。(3) LOX-1中和抗體實(shí)驗(yàn):采用不同濃度LOX-1中和抗體（5、10、20 ng/ml）預(yù)孵育細(xì)胞1h后低氧處理，real-time PCR或Western Blot檢測pERK1/2、pElk、MRTF-A、SRF、c-fos、α-SMAmRNA或蛋白表達(dá)。(4)

26、 LOX-1小分子RNA干擾(siRNA)實(shí)驗(yàn):當(dāng)PASMCs達(dá)到60％～70％融合后，采用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑分別將LOX-1 siRNA干擾片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，干擾LOX-1表達(dá)，real-timePCR或Western Blot檢測LOX-1 mRNA或蛋白的表達(dá)評價(jià)不同片段轉(zhuǎn)染效率，選擇最佳片段的合適濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。LOX-1 siRNA干擾24 h后低氧處理細(xì)胞，real-time PCR或Western Blot檢測p

27、ERK1/2、pElk、MRTF-A、SRF、c-fos、α-SMA mRNA或蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果: 1.低氧誘導(dǎo)PAH大鼠肺動脈及低氧誘導(dǎo)PASMCs中pERK1/2、pElk顯著激活，SRF、c-fos表達(dá)顯著增加而MRTF-A表達(dá)顯著降低;同時(shí)，α-SMA在低氧誘導(dǎo)PAH大鼠肺動脈中表達(dá)無明顯變化，但低氧誘導(dǎo)PASMCs可顯著下調(diào)其表達(dá);2.抑制LOX-1可顯著抑制低氧引起的pERK1/2、pElk激活以及SRF、c-fo