位點(diǎn)特異性重組酶FLP的拆分、重建及其在煙草中的重組活性分析.pdf

1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)自問世以來發(fā)展迅速,已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。該技術(shù)可有效地改良作物品質(zhì),提高作物產(chǎn)量,減少除草劑、殺蟲劑等農(nóng)藥的使用量,已經(jīng)給我們帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)利益。同時(shí),轉(zhuǎn)基因技術(shù)在解決全球性的能源危機(jī)、生物醫(yī)學(xué)和保障農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展等方面也扮演著越來越重要的作用。然而,公眾一直對轉(zhuǎn)基因技術(shù)推廣應(yīng)用所帶來的潛在生物安全性心存擔(dān)憂,人類對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的利弊爭論從未停止過,這些爭論和擔(dān)憂已嚴(yán)重制約著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)一步推廣應(yīng)用,因此,如何讓人

2、類在享受轉(zhuǎn)基因技術(shù)成果的同時(shí)又無須擔(dān)心其潛在的生物安全隱患,已經(jīng)成為當(dāng)前亟待解決的重大問題。
　　 前人的研究表明,基因刪除系統(tǒng)“Gene-deletor”可有效消除轉(zhuǎn)基因植物中所有的外源基因,但該技術(shù)仍不能應(yīng)用于雜交作物育種。為了將基因刪除系統(tǒng)應(yīng)用于大田生產(chǎn)中解決轉(zhuǎn)基因安全問題,本實(shí)論文對基因刪除系統(tǒng)“Gene-deletor”進(jìn)行了進(jìn)一步改進(jìn),將重組酶FLP進(jìn)行了拆分,構(gòu)建了一個(gè)可拆分的基因刪除系統(tǒng),通過轉(zhuǎn)化模式植物-煙草,

3、驗(yàn)證了該系統(tǒng)拆分并重建后仍具有高效的重組活性。論文具體結(jié)果如下:
　　 一、植物表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 以含有植物性內(nèi)含子Stlf1的重組酶FLP編碼序列為模板,采用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得重組酶FLP各拆分片段及全長片段,回收測序驗(yàn)證后連接至中間載體pCXSN上,而后通過中間載體FRT-NOS-FRT-pUC19獲得識(shí)別位點(diǎn)FRT,最后以pCambial305.1為骨架,篩選正義重組質(zhì)粒,構(gòu)建了一整套基因拆分系統(tǒng)植物

4、表達(dá)載體,共計(jì)12個(gè)。并將上述載體通過凍融法導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1和根癌農(nóng)桿菌EHA105中。
　　 二、轉(zhuǎn)基因毛狀根GUS染色分析
　　 通過葉盤法轉(zhuǎn)化模式植物煙草,獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根若干。GUS染色結(jié)果顯示,當(dāng)轉(zhuǎn)化未拆分的重組酶FLP全長編碼序列時(shí),可檢測到GUS活性,表明FLP/FRT系統(tǒng)可以在轉(zhuǎn)基因發(fā)根中起作用。當(dāng)重組酶FLP拆分為N端和C端片段后,基因刪除系統(tǒng)中含有單獨(dú)的FLP酶N端或C端時(shí)未檢測到GUS活性,

5、表明該蛋白片斷無重組活性;而當(dāng)刪除系統(tǒng)中同時(shí)含有拆分后的重組酶N端和C端編碼序列,GUS染色發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因毛狀根呈藍(lán)色,表明拆分重建后重組酶活性可以得到部分恢復(fù)。
　　 三、轉(zhuǎn)基因毛狀根中的分子驗(yàn)證
　　 根據(jù)植物表達(dá)載體上T-DNA區(qū)間序列,設(shè)計(jì)兩對特異性檢測引物,用于轉(zhuǎn)基因材料的分子檢測外源基因。PCR結(jié)果顯示所有載體的T-DNA區(qū)間均已成功導(dǎo)入到煙草的基因組中。
　　 提取含有不同F(xiàn)LP重組酶基因片段的轉(zhuǎn)基因

6、毛狀根DNA作為PCR模版,在識(shí)別位點(diǎn)FRT兩端的載體序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn),當(dāng)所有GUS染色呈陽性的轉(zhuǎn)基因毛狀根中,均可獲得一條377bp的擴(kuò)增條帶,表明FRT識(shí)別位點(diǎn)間的所有基因均被刪除;而在未發(fā)生刪除前,采用該引物,則擴(kuò)增獲得不同大小的擴(kuò)增條帶(目的片段+載體序列)。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)一步說明,在GUS陽性轉(zhuǎn)基因株系中外源基因被準(zhǔn)確刪除,僅有一個(gè)識(shí)別序列FRT殘留。
　　 四、拆分系統(tǒng)刪除效率分析

7、
　　 通過對毛狀根GUS染色,統(tǒng)計(jì)拆分后重組酶系統(tǒng)的刪除效率。選取轉(zhuǎn)化后煙草葉盤上獨(dú)立的30-50個(gè)毛狀根進(jìn)行GUS染色,統(tǒng)計(jì)GUS陽性毛狀根所占的比例。對每個(gè)轉(zhuǎn)化載體獲得的毛狀根重復(fù)統(tǒng)計(jì)三次,獲得平均值。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)化完整的重組酶FLP時(shí),它可在毛狀根中行使重組活性,刪除效率達(dá)到37.8%,而存在核定位信號時(shí)提高至43.5%;當(dāng)重組酶FLP被拆分為N端和C端后,其單獨(dú)存在時(shí)均無重組活性,而將拆分片段構(gòu)建為雙元表達(dá)載體后同時(shí)整