小鼠成體干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成肝能力比較及與絲素蛋白纖維相容性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　1.分離、培養(yǎng)小鼠脂肪及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，比較兩種成體干細(xì)胞體外增殖能力、多向分化潛能及向肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力;
　　2.比較兩種成體干細(xì)胞與絲素蛋白纖維在體外和體內(nèi)的相容性，以及在絲素蛋白纖維上誘導(dǎo)成肝能力;
　　3.比較兩種成體干細(xì)胞及兩種成體干細(xì)胞復(fù)合絲素蛋白纖維移植改善急性肝損傷小鼠肝功能的效果。
　　方法：
　　1.采用膠原酶Ⅰ消化離心法分離、培養(yǎng)小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞;采用骨片法分

2、離、培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞;通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較兩種成體干細(xì)胞的形態(tài)差異，CCK8測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物，成脂、成骨誘導(dǎo)分化能力分析比較兩種細(xì)胞的體外增殖能力及多向分化潛能;采用成肝誘導(dǎo)培養(yǎng)基將兩種成體干細(xì)胞向肝臟樣方向誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)第10天，收集細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR，Western-Blot技術(shù)、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)對(duì)兩種成體干細(xì)胞向肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力進(jìn)行鑒定、比較。
　　2.體外采實(shí)驗(yàn)部分HE染色、掃

3、描電鏡技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡細(xì)胞活體3D成像技術(shù)檢測(cè)兩種成體細(xì)胞與絲素蛋白纖維的粘附性及增殖情況;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分將絲素蛋白纖維材料移植到小鼠背上，在移植后的第3、4個(gè)月取材，采用HE染色觀察材料的降解情況;將CM-Dil熒光標(biāo)記的兩種成體干細(xì)胞移植到RSF材料上，并移植到急性肝損傷小鼠模型肝臟表面，在不同時(shí)間點(diǎn)（2天、5天、7天、14天、1個(gè)月）用小動(dòng)物活體顯像技術(shù)及熒光顯微鏡觀察移植細(xì)胞的在材料上的定植情況，同時(shí)采用HE染色的方法觀察不

4、同時(shí)間點(diǎn)（2天、5天、7天、14天、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月）移植細(xì)胞材料在肝臟表面的定植、分化情況以及RSF材料與肝臟組織的相容性。
　　3.采用CCl4（0.5ml/kg，100ul/20g體重）腹腔注射法構(gòu)建小鼠急性肝損傷模型;采用熒光追蹤技術(shù)觀察經(jīng)尾靜脈移植到小鼠體內(nèi)的CM-Dil標(biāo)記的兩種成體干細(xì)胞，并將分別兩種成體干細(xì)胞與材料復(fù)合后移植到肝臟表面，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（N=5只）小鼠肝功能，并采用HE染

5、色法不同實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肝臟組織學(xué)的改變。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，用T檢驗(yàn)、單因素所方差分析對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.采用膠原酶Ⅰ培養(yǎng)的ADSCs和骨片法培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭形，旋渦狀生長(zhǎng)，兩者形態(tài)基本一致。兩種成體干細(xì)胞增殖曲線均呈“S”型，CCK8檢測(cè)增殖活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);兩種成體干細(xì)胞表型均表達(dá)CD90.2、CD29，不

6、表達(dá)CD11b、CD45，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;兩種成體干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后均出現(xiàn)脂滴和骨結(jié)節(jié)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示相比于對(duì)照組細(xì)胞，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組高表達(dá)ALB、AFP、CK18、CK19、CYP1A1肝細(xì)胞相關(guān)基因;Western蛋白定量的結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，兩種成體干細(xì)胞中ALB、AFP、CK18、CK19、CYP1A1的蛋白表達(dá)量均升高，無(wú)明顯差異。成肝誘導(dǎo)后細(xì)胞免疫熒光顯色提示兩種細(xì)胞均檢測(cè)到組ALB、AFP、CK18、CK19、CY

7、P1A1的表達(dá)。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)部分:HE染色可見(jiàn)細(xì)胞均勻分布于材料表面，材料內(nèi)部也有少許細(xì)胞;掃描電鏡顯示兩種成體干細(xì)胞在RSF材料上呈旋渦狀生長(zhǎng)，形態(tài)基本不變，粘附性良好;激光共聚焦細(xì)胞活體3D成像結(jié)果顯示兩種不同成體干細(xì)胞在材料不同層面上均可以生長(zhǎng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:小鼠背部絲素蛋白材料移植后第3、4個(gè)月HE染色顯示材料與組織相容性良好;小動(dòng)物活體顯像和熒光顯微鏡觀察顯示CM-Dil熒光標(biāo)記的兩種成體干細(xì)胞-絲素蛋白纖維復(fù)合材

8、料移植后的2天、5天、7天、14天和1個(gè)月均能檢測(cè)到CM-Dil熒光標(biāo)記的兩種成體干細(xì)胞;HE染色結(jié)果顯示在成體干細(xì)胞-RSF復(fù)合材料移植的2天、5天、7天、14天、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月材料與肝組織間相容性良好，無(wú)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，移植在背部的RSF材料在第4個(gè)月幾乎完全降解，移植在肝臟的RSF材料在第3個(gè)月幾乎完全降解;此外，在第5天和第7天發(fā)現(xiàn)材料有新生血管生成，在2個(gè)月和3個(gè)月觀察到新生的肝臟樣細(xì)胞。
　　3.成功構(gòu)建了小

9、鼠急性肝衰的動(dòng)物模型;細(xì)胞移植組小鼠存活狀況好于CCl4注射組。熒光示蹤技術(shù)顯示經(jīng)尾靜脈移植的兩種成體干細(xì)胞均能在肝臟定植，在移植的第1天、2天、3天、7天均可在肝臟檢測(cè)到熒光標(biāo)記的細(xì)胞，第3天數(shù)量達(dá)到最大，第7天標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量減少。肝功能檢測(cè)顯示:在第1天、2天、3天細(xì)胞治療組和細(xì)胞-材料治療組均顯示出了對(duì)急性肝損傷小鼠肝功能的救治作用，而細(xì)胞-材料治療組肝功能改善作用最好，在第7天，所有小鼠肝功能基本恢復(fù)正常;HE染色顯示:治療組肝

10、細(xì)胞脂肪樣變性和肝小葉中央靜脈的淤血壞死區(qū)域有不同程度的改善。
　　結(jié)論：
　　1.兩種成體干細(xì)胞具有類(lèi)似的體外的增殖能力，且均能有效地誘導(dǎo)成為肝臟樣細(xì)胞;ADSCs取材容易，不涉及倫理問(wèn)題，原代即增殖迅速，短期內(nèi)可獲得大量細(xì)胞，因此是生物人工肝的種子細(xì)胞的優(yōu)良選擇。
　　2.ADSCs和BMSCs均可較好的在在RSF材料能夠粘附、增殖，并且兩者具有良好的生物相容性。說(shuō)明可能兩種成體干細(xì)胞-RSF材料是一種良好的生物人