蜘蛛毒素作用受體的分離與鑒定.pdf

1、自然界的天然毒素是人類可以利用的寶貴資源。目前，自然界的動(dòng)物毒素尤其是蜘蛛毒素已引起相關(guān)科學(xué)工作者濃厚興趣。蜘蛛毒素種類繁多、功能多樣，在神經(jīng)生物學(xué)和藥理學(xué)等方面具有重要的應(yīng)用前景。近年來，對蜘蛛毒素的研究取得了重大進(jìn)展，用電壓鉗和膜片鉗等電生理技術(shù)對許多作用于細(xì)胞膜上的電壓門控離子通道如鉀、鈉、鈣離子通道的毒素的性質(zhì)進(jìn)行了分析。這些技術(shù)已成為研究毒素作用機(jī)理的主要方法。但電壓鉗和膜片鉗技術(shù)用于鑒定毒素的結(jié)合蛋白質(zhì)時(shí)具有一定的局限性，因

2、為它們往往是定向的使用不同類型的離子通道或其亞型去探測蜘蛛毒素的活性。在本研究中，我們選取一種具有代表性的蜘蛛神經(jīng)毒素虎紋捕鳥蛛毒素-I(HWTX-I)為材料，采用基于生物素標(biāo)記的策略，通過檢測和鑒定HWTX-I在神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜上的結(jié)合蛋白(泛稱受體)的方法探討HWTX-I的功能，從而獲得關(guān)于HWTX-I作用機(jī)理的更直接的信息。
　　 HWTX-I是從虎紋捕鳥蛛粗毒中分離純化出的一種分子量為3.75 kDa的多肽神經(jīng)毒素。它由33

3、個(gè)氨基酸殘基組成，含3對二硫鍵。電生理實(shí)驗(yàn)表明它能可逆性阻斷小鼠膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本的神經(jīng)肌肉接頭傳遞。為了檢測它在膈神經(jīng)-膈肌的神經(jīng)肌肉接頭中的受體，本文利用EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin對純化的HWTX-I進(jìn)行標(biāo)記，再利用生物素化的HWTX-I(biotin-HWTX-I)與富含神經(jīng)肌肉接頭的大鼠膈肌細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)作用。通過兩種方式分離和鑒定與biotin-HWTX-I結(jié)合的蛋白質(zhì)。一種是用biotin-HWTX-I與

4、制備的質(zhì)膜碎片孵育再用交聯(lián)劑BS3進(jìn)行交聯(lián)，然后用含去污劑的緩沖液提取蛋白質(zhì)并用SDS-PAGE進(jìn)行分離。凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上后用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白(HRP-avidin)檢測和顯影。另一種方法是先將大鼠膈肌細(xì)胞質(zhì)膜的蛋白質(zhì)提取并進(jìn)行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜后對PVDF膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)性處理，再與biotin-HWTX-I進(jìn)行孵育，最后用HRP-avidin檢測和顯影。對兩種方法中顯現(xiàn)的條帶的蛋白質(zhì)用

5、CapLC-MS/MS進(jìn)行分析鑒定。
　　 生物質(zhì)譜和電生理技術(shù)證明本研究中制備的biotin-HWTX-I為標(biāo)記上一個(gè)生物素基團(tuán)的修飾產(chǎn)物，生物素標(biāo)記未影響其生物學(xué)活性。在分析結(jié)合蛋白的第一種方法中，利用HRP-avidin在PVDF膜上大約72 kDa，的位置顯示出條帶，提示該條帶很可能含有HWTX-I的結(jié)合蛋白。為了檢測蛋白質(zhì)中是否含有內(nèi)源性抗生物素蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，我們利用未標(biāo)記的HWTX-I以及不用HWTX-I的空白對照

6、進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明兩種情況下都在相同的位置有條帶顯現(xiàn)，且未標(biāo)記HWTX-I存在時(shí)的條帶顏色比不用HWTX-I時(shí)的條帶顏色淺。這說明質(zhì)膜蛋白質(zhì)本身具有內(nèi)源性抗生物素蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而且抗生物素蛋白的結(jié)合位點(diǎn)很可能與HWTX-I的相同或大部分重疊。在分析HWTX-I受體的另一種方法中，膜蛋白被提取、SDS-PAGE分離和轉(zhuǎn)至PVDF膜上后才用biotin-HWTX-I進(jìn)行檢測。為了研究蛋白質(zhì)復(fù)性處理對HWTX-I與蛋白結(jié)合的影響，對HWTX

7、-I與膜上蛋白質(zhì)復(fù)性處理前后的結(jié)合差異進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，對膜上蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)性處理后HWTX-I與蛋白質(zhì)的結(jié)合增強(qiáng)。與此同時(shí)，我們還利用HRP-avidin在不同實(shí)驗(yàn)條件下檢測PVDF膜上的蛋白質(zhì)或biotin-HWTX-I，高濃度的抗生物素蛋白并不能完全阻斷HWTX-I與潛在的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合(反之亦然)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了avidin和HWTX-I在結(jié)合蛋白質(zhì)中的結(jié)合位點(diǎn)并不完全重疊。
　　 將HRP-avidin顯現(xiàn)的條帶中的