東亞鉗蝎毒素ITX的分離鑒定及氨基酸含量測(cè)定.pdf

1、目的:測(cè)定東亞鉗蝎毒素ITX(Immunetoxin,ITX)的氨基酸含量;建立蝎毒素ITX逐級(jí)分離純化的方法;利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,建立分辨率高和重復(fù)性好的東亞鉗蝎毒素ITX(以下簡(jiǎn)稱(chēng)蝎毒素ITX)蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳圖譜,篩選并鑒定某些組分的結(jié)構(gòu)。
　　方法:將常壓柱分離得到的蝎毒素蛋白ITX,進(jìn)行氨基酸含量分析;高效液相分離蝎毒素ITX;陰極電泳對(duì)蝎毒素ITX進(jìn)行一維分離;制備蝎毒素ITX蛋白樣本,以17cmpH3-10固相p

2、H梯度膠條(immobilizedpHgradiednt,IPG)做第一向等電聚焦(IEF);18％SDS聚丙烯酰胺凝膠為第二向進(jìn)行雙向電泳(2-DE);PDQuest7.1分析軟件分析電泳圖譜,篩選目的蛋白,對(duì)其中兩個(gè)重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好的蛋白點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析,得到肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)數(shù)據(jù),登陸網(wǎng)站http://www.matrixscience.com,用Mascot程序檢索NC

3、BInr數(shù)據(jù)庫(kù),鑒定蛋白質(zhì)。
　　結(jié)果:蝎毒素ITX17種氨基酸的含量從0.14%～11.35%不等;經(jīng)高效液相分離得到5個(gè)峰;經(jīng)陰極電泳分離得7條帶;從蝎毒素ITX蛋白樣品中共篩選出9個(gè)等電點(diǎn)不同,分子量約為5800D的蛋白點(diǎn),其中蛋白點(diǎn)1、2、3、4位于酸性區(qū),相對(duì)豐度較低,蛋白點(diǎn)5、6、7、8、9位于堿性區(qū),相對(duì)豐度較高。獲得了蝎毒多肽的PMF數(shù)據(jù),蛋白點(diǎn)未得到鑒定,需要更換檢索條件或進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)序才能進(jìn)行進(jìn)一步認(rèn)定。