gc-ms分析方法測(cè)定鳀魚糞便中氨基酸的相對(duì)含量

1、技 經(jīng) 濟(jì)市 場(chǎng) GC — MS分析方法測(cè)定鯤魚糞便 中氨基酸 的相對(duì)含量 劉海珍 劉加珍 ( 聊城大學(xué)環(huán)境與規(guī)劃學(xué)院， 山東 聊城 2 5 2 0 5 9 )摘 要 ： 采用 G C — M S 分析 方法測(cè)定 了 黃 東海生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵種鯤魚肌 肉及其 糞便 中的氨基酸含 量 ， 經(jīng) 比較鯉魚糞便 中各類氨基酸含量偏低 ， 并且種類間含量差距較 大。關(guān)鍵詞 ：魚肌肉； 呢魚糞便 ； 氨基酸 ； 含量 關(guān)鍵資源種群食物網(wǎng)能量流動(dòng)是認(rèn)識(shí)

2、東 黃海 生態(tài) 系統(tǒng) 資源 生產(chǎn)及其動(dòng)態(tài)的關(guān)鍵生物過程 。魚俗稱 出水爛 ， 該 魚種是黃東海生態(tài)系統(tǒng)食物 網(wǎng)中起著 承上啟下作用 的關(guān)鍵種 ， 從它 的新陳代i 胄 } 作 用中營養(yǎng)成分 的豐 度及其組成 的變化著手 ，試 圖以營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)化 與吸收率來反 映其營養(yǎng)質(zhì)量把氨基酸含量作 為營養(yǎng)質(zhì)量的研究參數(shù) ，有助于 研究營養(yǎng)質(zhì)量在食物網(wǎng)中的作用 。魚糞便 樣品是 雌魚 的排泄 物及代謝物質(zhì)成分 ， 討論其 中的氨基酸相對(duì)含量及魚肌 肉

3、 一 魚糞便 氨基酸含量的變化是對(duì)東黃海簡化食物鏈氨基酸變化 進(jìn)行初步探討 的一個(gè)重要環(huán)節(jié) 。鰣魚用標(biāo)準(zhǔn)小型生物 網(wǎng)， 自 水底至水表垂直在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 池中采樣 ， 魚糞 由培養(yǎng)箱虹吸法析出收集采樣 。魚類樣品采集 后， 取其適量 背部肌 肉， 真空干燥后磨碎， 備用 。魚糞樣品經(jīng)真空 干燥 備用 。魚的室 內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)本身就是一項(xiàng) 創(chuàng)新性 的： ￡ 作 ， 此 前圈內(nèi)還 沒有人 r 培養(yǎng) 魚的先例 。該培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)既可研究 氨基酸在該關(guān)鍵

4、種 食物鏈 中的傳遞 ，又可研究咣魚代謝過程中氨基酸組成與含量變化的影響。在 國 內(nèi)外尚未見有類似實(shí)驗(yàn)研究 的報(bào)道 。 用 G C — MS 分析氨基酸的國 內(nèi)報(bào)道很 少，采用 三氟醋酸酐與酸性正丁醇作 為氨基酸的衍生 化試劑， 對(duì)衍生化條件 和色譜操 作條件進(jìn)行 了優(yōu)選， 建立 了樣 品 中氨基酸 的分離及定性 定量分析方法， 該法分析速度快 ， 樣 品處理簡單，分離效 果好，定量準(zhǔn)確。1 材料 與方 法 1 ． 1 儀器、 試劑與方

5、法 處理和交換單元 ， 因此存在較大的延時(shí)和抖動(dòng)。 而 且由于接 n之 間沒有 直接對(duì)應(yīng) ， 鏈路的帶寬利用效率也成問題 。 這種方式就好 比城市公路交通 ，有許多十字路 口， 都需要紅綠燈進(jìn)行調(diào)度管 理 ， 容易造成 交通堵塞。而在 R P R結(jié)構(gòu) 中， 就能夠很好地避免 以上問題。這個(gè)結(jié)構(gòu)類 似城市的環(huán)形公路 ， 環(huán)路內(nèi)部各站都能直通 ， 基 本上不用紅綠燈 ， 效率更高。 一 個(gè) R P R節(jié)點(diǎn)具有一個(gè) M A C實(shí)體 和兩個(gè)物理

6、層實(shí)體。物理層實(shí)體與鏈路關(guān)聯(lián) 。MA C實(shí)體包含一 個(gè) M A C控制實(shí)體和 2個(gè) M A C業(yè)務(wù)鏈路實(shí)體 ， 并稱之 為接入點(diǎn) ，每個(gè)接人點(diǎn)與每個(gè)環(huán)路相關(guān)聯(lián) 。物理層實(shí)體根據(jù)環(huán)路方向分 為東 向物理層 和西向物理 層 。這里 東 向或 西向是約 定節(jié)點(diǎn)處 在R P R北側(cè) 為基準(zhǔn)的 。東 向物理層 的“ 發(fā) 送 口” 與西 向物理層 的“ 接收 口” 通 過 M A C 實(shí)體連接 在一起 ， 構(gòu)成 R P R的外環(huán) ； 同樣 ，東 向

7、物理層 的“ 接收 口” 與西 向物理 層 的“ 發(fā)送 口” 相連 ， 構(gòu) 成 R P R內(nèi)環(huán)。4R P R的技術(shù)優(yōu)勢(shì) 通過 與傳統(tǒng)分組 交換 的對(duì) 比分析可知“ 彈性 ” 帶來 的優(yōu)點(diǎn)主 要有以下幾點(diǎn) ：( 1 ) 業(yè) 務(wù)分級(jí) ： 將業(yè) 務(wù)分 為 3 級(jí) A ， B ， c ． 其 中 A細(xì)分 為兩 。 級(jí) ， B細(xì)分為兩級(jí) 。數(shù)據(jù)類 型實(shí) 際上被分 為 5級(jí) ， 每一級(jí)有不 同 的 Q o S ， 保證業(yè)務(wù)的 區(qū)分 度 ， 分 別對(duì)

8、應(yīng)實(shí)時(shí)業(yè) 務(wù) ， 非實(shí)時(shí)業(yè)務(wù)和 盡力傳送 。( 2 ) 拓?fù)?自動(dòng)發(fā)現(xiàn) ： 保證 了對(duì)環(huán) 上新增和移去的節(jié)點(diǎn) ， 動(dòng)態(tài) 實(shí)現(xiàn)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)更新 。如果要增加或者減少 R P R上的總帶寬 ， 則 可以結(jié)合 L C A S 功能來實(shí)現(xiàn)。使用 L C A S 可以動(dòng)態(tài) 的調(diào)整帶寬 ，而不影響原有業(yè)務(wù)。( 3 ) 空間重用 ： R P R單播 幀在 日的節(jié)點(diǎn)剝離 的機(jī)制 ， 實(shí)現(xiàn) 了環(huán)上帶寬的空間重用 。 環(huán)上帶 寬可 以幾個(gè)點(diǎn)的業(yè) 務(wù)共用 ， 帶

9、寬利 用率提高 。( 4 ) 公平算法 ： R P R內(nèi)環(huán)和外環(huán)都 支持獨(dú)立 的公平算法 。公 平算法保證 了低優(yōu)先級(jí) 的 B — E I R和 C類業(yè) 務(wù)在 R P R環(huán)上的公 平接入。 通過設(shè)置公平算法 的權(quán)重 ， 可 以使不同的結(jié)點(diǎn)具有不同的接入速率。節(jié)點(diǎn)可 以分別在外環(huán)和內(nèi)環(huán)上設(shè)置不同的權(quán)重。( 5 ) 保護(hù) ： w r a p p i n g + s t r i n g ， w r a p p i n g相當(dāng)于斷纖處環(huán) 回，

10、倒換 時(shí)間快 ， 但是路徑不是最優(yōu) 。 S t r i n g 保護(hù)模 式倒換時(shí)間慢 ， 但選擇 最優(yōu)路徑。5 結(jié)束語 R P R技術(shù)作 為一種 在環(huán) 型結(jié)構(gòu)上優(yōu) 化數(shù)據(jù)業(yè) 務(wù)傳送 的新 型 MA C層 協(xié)議 ， 能夠適應(yīng)多種物理層 ( 如 S D H、 以太網(wǎng) 、 D WD M等 ) ， 可有效地傳送數(shù)據(jù) 、 語音和圖像等多種業(yè)務(wù)類型。 它融合了以 太 網(wǎng)技術(shù) 的經(jīng)濟(jì)性 、靈活性和可擴(kuò)展性等特點(diǎn) ，同時(shí)吸收了S D H環(huán)網(wǎng)的 5 0

11、m s 快速保護(hù)的優(yōu)點(diǎn) ， 并具有 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)?自動(dòng)發(fā) 現(xiàn) 、環(huán)路帶寬共享 、 公平 分配 、 嚴(yán)格 的業(yè) 務(wù)分類( C O S ) 等技術(shù)優(yōu)勢(shì) ，目 標(biāo)是在不降低網(wǎng)絡(luò)性 能和 可靠性的前提下提供更加經(jīng)濟(jì)有效 的城域 網(wǎng)解決方案。2 ( ) 1 n年第 1 2期 技經(jīng)濟(jì)市場(chǎng) 樣 品的 測(cè)定 分 析是 在 A g i l e n t6 8 9 0 N氣 相 色 譜儀 ， 5 9 7 3 N質(zhì)譜儀 ( G C — M S ) 上進(jìn)行 的。 L

12、 一 谷氨酸 ， L 一 蘇氨酸 ， L 一 苯丙氨酸 ，L 一 甘氨酸 ， 分析純 ； 鹽酸 H C 1 ， 優(yōu) 級(jí)純 ； 正丁醇， 色譜純 ；乙酰氯 C H 3 C O C 1 ， 分析 純 ； 二氯 甲烷 ， 色譜 純 ； 三 氟 乙酸酐 ( C H 3 C O ) 2 O ， 色譜純 ， 購 自 美 國 S i g m aC h e m i c a l 公 司。氨基酸屬非揮 發(fā)性 物質(zhì) ， G C — MS分析測(cè)定氨基 酸須經(jīng)衍

13、生 化反應(yīng)使之成 為易于氣化的物質(zhì) ， 實(shí)驗(yàn)采用生成三氟 乙酰氨基 酸正丁酯的方法對(duì)氨基酸進(jìn)行 了衍生化 。1 ． 2GC — MS條 件 色譜 柱 ： H P 一 5 M S ， 3 0 m× 0 ． 2 5 m m l D× 0 ． 2 5m 。氣相色譜操 作條件 ： 氣化室溫度 ， 2 5 0 ~ C ； 傳輸線溫 度 ： 2 8 0 ％ ； 色譜 柱升溫程 序 ： 初溫 5 0 ℃ ， 以 2 0 ℃， m

14、i n升至 2 2 0 ℃， 以 1 0 ℃／ m i n升至 2 8 0 ℃ 并保持 3 m i n 。進(jìn)樣 方式 ： 不分流進(jìn)樣 。進(jìn)樣量 ： 1L 。質(zhì)譜 ： E I 離子源 ， 倍增器電壓 1 2 0 0 V ， 離子源溫度 ： 2 3 0 ~ ( 2 ， 四極桿 溫度 ： 1 5 0 ℃， 全掃描( S C A N) 質(zhì)量范 圍為 3 3 ～6 0 0 m a u ， 各組 分的峰面積是從 全掃描 的總離子流色譜 圖中積分得到

15、。將 所 得 的 1 6種 標(biāo) 準(zhǔn) 氨基 酸 的混 合 物 衍 生 物 的譜 圖與 G C — M S 分析測(cè)定 出的樣品譜 圖進(jìn)行 比較 ， 根據(jù)保 留時(shí)間 、 結(jié)合 分子式 、分子量通過計(jì)算機(jī)檢索和人工解析相結(jié)合的方法進(jìn)行 鑒定 ， 并使用外標(biāo)法定量分析[ 2 1 ， 測(cè)定 中共 確證 出糞便樣 品的 1 4種氨基酸及 各 自的含量。1 ． 3 樣品的測(cè)定 測(cè)定樣 品的實(shí)驗(yàn)是分前后兩步進(jìn)行的 ，首先測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)氨基 酸 ， 得到 了標(biāo)準(zhǔn)

16、氨基酸 的譜圖 ， 實(shí)驗(yàn)方法得以基本建立 ， 然后 ， 測(cè) 定樣品中單體氨基酸的組成 。1 ． 3 ． 1標(biāo)準(zhǔn)氨基 酸樣 品的測(cè)定 標(biāo) 準(zhǔn)氨基酸樣品的衍生化 ； 即將極性強(qiáng) 、 熱穩(wěn)定性差 、 化學(xué) 活性強(qiáng) 的氨基酸衍生化 為極性弱 、 易揮發(fā) 、 熱穩(wěn)定性好 的氨基酸 酯。將 N H 4 C 1 與濃 H 2 S O 4 反應(yīng)制得 的 H C 1 氣體通人異丙醇溶液 中 ， 配得 3 m o l ／ 1 的鹽酸異丙醇溶液 ；并于每毫升

17、此溶液中加入 2 5l 已酰氯 。稱取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣約 4 m g ， 用 0 ． 1 m o l ／ 1 的鹽 酸在 1 0 毫升容量瓶中定容 ， 配成鹽酸氨基酸溶液 ， 每次取 0 ． 5 m l 該溶 液 于玻璃 安瓶 中 ( 混合 標(biāo)樣每 種樣 品取 約 0 ． 1 ml 于一 個(gè)安 瓶 中) ； 加入 2 ． 0 m l 3 m o l ／ 1 的鹽 酸異丙醇溶液 ( 以上所 配 ) ； 封 口后在 1 1 0 ℃的恒溫干燥箱中

18、酯化 1 小時(shí) ；反應(yīng)完畢后取 出放至室溫 ，然后切割安瓶將樣品轉(zhuǎn)移 至另一安瓶 中 ； 在 2 5 c C 的真空干燥箱 中干燥 ， 加入 0 ． 5 m lC H 2 C 1 2 ， 然后再蒸發(fā)至干。干燥后 的樣 品瓶 中加入 C H 2 C 1 2 和 T F A A各 0 ． 2 5 m l ；封 口后在 1 1 0 ℃恒溫干燥箱 中?；?1 0 m i n ， 反應(yīng)完畢后取 出放至室溫 。打開安瓶 ， 將安瓶放 在 裝有 冰水

19、 混 合物 的燒 杯 中 ，在 真空 干燥 箱 中抽 走 剩余 的C H 2 C l 2 和 T F A A ； 最 后將反 應(yīng)產(chǎn)物 溶在 0 ． 5 m l C H 2 C 1 2 中， 移入 測(cè) 樣瓶中 ， 封 口， 放人 4的冰箱中待用 。G C — C — I R M S 分析 ； 首先對(duì)每種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸 的衍生物作單獨(dú) 的 G C — M S 分析 ，以確定 每種氨基酸的色譜峰峰型和保 留時(shí)間 ，然后 ， 用人工配制 的 1 6

20、 種混合物衍生物進(jìn)行 實(shí)驗(yàn) ， 以確定各 個(gè) 色譜峰 的分辨效果 ， 結(jié)果示于 圖 l 。1 ． 3 ． 2樣品的處理 應(yīng)用 G C — C — I R M S 方法測(cè)定糞便樣 品中單 體氨基酸組成的 測(cè)定方法主要有 3 部分組成 ： 樣 品的酸解 ， 氨基酸 的衍生化預(yù)處 理和 G C — MS 儀器測(cè)定 。氨 綦酸的名褥 占總氯基酸的質(zhì)量 分?jǐn)?shù) 麗氫酸 A L A5 ． 8 8甘 氮 酸G L Y9 ． 2 9蘇氨酸 T H R5

21、 ． 4 5絲 氮 酸 S Z R5 ． 4 8纈氨酸 V A L6 ． 4 9； 亮 氫酸L E U3 ． 5 9異亮 氯酸 L 砸 3 ． 0 8； 睛 氨 酸3 ． 1 5蛋氨酸 ME T0 ． 5 2天 f ] 冬氨酸 A S P5 ． 9 7苯 丙氨酸 P H E1 ． 2 7組氨酸 H I S。酪 氨酸 T Y R 5 ． 3 2l賴 氮酸 L Y S0 ． 7 0 1l 各氯酸 G L U8 ． 9 9圖 1魚糞便 中

22、氨基酸相對(duì)含 量( ％)樣品的酸解及氨基酸的衍生化預(yù)處理 ；準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥 的 樣品幾毫克 ， 稱 取 3 份 ， 分別放 入安 瓶中 ， 各加 入 5 ． 0 m l6 ． 0 m o l ／ 1的恒沸鹽 酸 ， 封 口后在 1 0 0 ~ C 恒溫箱 中水解 1 8 小 時(shí) ， 冷卻至 室 溫 ， 切割 ， 趁熱過濾 ， 定容 5 ． 0 ml ， 其后與標(biāo)準(zhǔn)樣品處理相 同。 樣 品 的衍生化處理 的具體方法同于標(biāo)準(zhǔn)樣的衍生化處理

23、。G C — M S 儀器分析 ； 經(jīng)氣相色譜柱分離得到 了氨基酸樣 品的譜 圖 ， 與標(biāo)準(zhǔn)氨基 酸譜圖( 圖 1 ) 比較及 加 以數(shù)學(xué) 處理可得 出糞 便樣 品中所含氨基 酸的含量及種類。2 結(jié)論 做為鰓魚的代榭產(chǎn)物 ，魚糞便 中氨基酸組成非常不均衡 ，氨基酸庫 中含量最高的是甘氨酸 ， 比例接近 1 0 ％， 說 明鰻魚對(duì)甘 氨酸 的代謝量大 ， 甘氨酸在 鰻魚體 內(nèi)相對(duì)最過剩 。 含量最低的是 苯丙氨酸 ， 總氨基酸的比例不到

24、2 ％， 兩者相差份額接近 9 ％。甘氨酸、 絲氨酸、 蘇氨酸 、 纈氨酸 、 天冬氨酸在 氨基酸庫 中組 成 比較均衡 ， 在 魚肌 肉中這幾種氨基 酸組成也是 比較 均衡 的，亮氨酸 、 異亮氨酸、 脯氨酸在氨基酸 中的 占有率比較低 。 鯉魚糞 便 中各種 氨基酸含量低于魚 肉樣 品， 含量差距較大。參考文獻(xiàn)：【 1 】中國海 洋學(xué)會(huì)． 2 1 世 紀(jì)中國海洋科學(xué)與技 術(shù)展 望『 M 】 ． 北京 ： 海洋 出 版 社 ． 1 9

25、 9 8【 2 J 房英玉 ， 尹起 范 ， 姚艷紅等 熊膽等幾種動(dòng)物膽 中氨基酸的 色 譜 一質(zhì)譜 分析 卟分析化 學(xué)研究 簡報(bào)， 1 9 9 7 ， 2 5 ( 1 2 ) ： 1 4 4 2 ～1 4 4 5 ．作者簡介 ： 劉海珍 ( 1 9 8 0 一 ) ， 女 ， 漢族， ， 山東泰安人， 講師， 從 事海洋分析化 學(xué)研究。2 0 1 0 年 第 1 2 期 基金項(xiàng) 目： 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 4 0 8 7 1 2 3