昆蟲病原菌菌株RG-1的分離鑒定及其殺蟲毒素蛋白的分離純化與活性研究.pdf

1、采用大蠟螟幼蟲誘捕的方法從土樣中誘捕昆蟲病原微生物，對得到的昆蟲病原微生物進行分離，經(jīng)過純培養(yǎng)后，再進行回復(fù)感染實驗，得到了1株殺蟲活性較強的昆蟲病原細菌菌株RG-1。對菌株RG-1進行分類鑒定，結(jié)果表明，其生理生化性狀與Serratia marcescens subsp.Sakuensis的比較吻合，只有2個性狀不同，而與Serratianematodiphila有9個性狀不同，與Serratia marcescens subsp.M

2、arcescens也有8個性狀不一樣。16S rDNA同源性比對分析表明菌株RG-1與Serratia marcescens subsp.Sakuensis的16SrDNA的同源性最大為99.855％，與Serratia nematodiphila的同源性亦為99.855％，與Serratia marcescens subsp.Marcescens的同源性次之為99.566％。通過構(gòu)建菌株RG-16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合生理生化性

3、狀從而確定其為沙雷氏菌（Serratia）。
　　 菌株RG-1革蘭氏染色反應(yīng)呈陰性，菌體呈桿狀，周身鞭毛；菌落顏色為紅色或淡粉紅色，圓形且平坦，邊緣光滑，并且相互粘連，單菌落較難分開。菌株RG-1能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、木糖、淀粉、甘露糖、纖維二糖、山梨糖、肌醇、衛(wèi)芳醇、阿拉伯醇、側(cè)盞金花醇、甘露醇、木糖醇、苦杏仁苷、膽汁七葉苷、七葉苷、鳥氨酸、粘液酸、尿素、葡萄糖酸鹽、枸櫞酸鹽、N-乙酰葡萄糖胺、葡萄糖胺，不能利用

4、乳糖、棉子糖、赤蘚醇、丙酮酸鈉、酒石酸鹽、丙二酸鹽、丙二酸鹽、糊精。菌株RG-1氧化酶反應(yīng)為陰性，接觸酶反應(yīng)為陽性，蛋白酶反應(yīng)為陽性。實驗測得其生長曲線符合一般細菌的生長規(guī)律；其在pH2至pH12的情況下都能生長，其最適生長pH為8.00；鹽濃度耐受范圍為1％-10％，最適生長鹽濃度為1％。
　　 測定RG-1發(fā)酵液上清對大蠟螟初孵幼蟲和老熟幼蟲的毒力，當1 g人工飼料中添加100μg發(fā)酵液凍干粉時，其對初孵幼蟲的校正死亡率為3

5、3.6％，168 h后體重抑制率為52.2％。向老熟幼蟲血腔內(nèi)注射20μL濃度為1.0μg·μL-1的發(fā)酵液凍干粉溶解液，其校正死亡率為93.3％。將昆蟲病原細菌菌株RG-1的菌體細胞濃度稀釋成如下梯度：107、106、105、104、103、102、101，注射大蠟螟老熟幼蟲血腔內(nèi)，測得其半數(shù)致死劑量為187.66個菌體細胞。發(fā)酵液上清液中的殺蟲物質(zhì)對蛋白酶K敏感，上清液蛋白酶K水解處理后殺蟲活力下降很大，死亡率僅為31.1％；表明發(fā)

6、酵液中殺蟲活性主要組分為蛋白質(zhì)。
　　 RG-1菌株胞外殺蟲蛋白粗提物對大蠟螟初孵幼蟲的胃毒毒力很高，當1 g人工飼料中添加100μg殺蟲蛋白粗提物時，168 h后校正死亡率達到45.5％，生長抑制率也達到了75.2％。將殺蟲蛋白粗提物溶解，并稀釋到濃度為1.6μg·μL-1，用微量注射器將稀釋好的殺蟲蛋白粗提物10μL注射到大蠟螟的血腔內(nèi)，24 h后大蠟螟校正死亡率為95.2％。表明菌株RG-1胞外殺蟲活力比較強。
　　

7、 RG-1胞外殺蟲蛋白粗提物凍干粉經(jīng)Sephadex G-75凝膠層析出現(xiàn)2個峰，分別命名為RGS-Ⅰ和RGS-Ⅱ。檢測胃毒活力時，都按照1 g人工飼料中添加100μg凍干粉的比例分別添加RGS-Ⅰ和RGS-Ⅱ，RGS-Ⅰ校正死亡率為50.7％，168 h后體重抑制率為77.3％；RGS-Ⅱ校正死亡率為29％，體重抑制率為25.4％；該結(jié)果顯示RGS-Ⅰ為胃毒力活性峰。檢測血腔毒力時，向每頭大蠟螟體內(nèi)注射10μL濃度為1.6μg·μL

8、-1殺蟲蛋白凍干粉溶解液，RGS-Ⅰ的校正死亡率為94.1％，RGS-Ⅱ的校正死亡率為30.6％，表明RGS-Ⅰ為血腔毒力活性峰。
　　 將RGS-Ⅰ過DEAE Sepharose FF陰離子交換柱，得到2個峰，分別命名為RGD-Ⅰ和RGD-Ⅱ。檢測胃毒活力時，都按照1 g人工飼料中添加100μg凍干粉的比例分別添加RGS-Ⅰ和RGS-Ⅱ，RGD-Ⅰ校正死亡率為27.9％，體重抑制率為24.2％，RGD-Ⅱ校正死亡率為55.6％

9、，體重抑制率為78.2％，結(jié)果顯RGD-Ⅱ為胃毒力活性峰。檢測血腔毒力時，向每頭大蠟螟體內(nèi)注射10μL濃度為1.6μg·μL-1殺蟲蛋白凍干粉溶解液，RGD-Ⅰ校正死亡率為28.3％，RGD-Ⅱ校正死亡率為91.7％，結(jié)果顯示為RGD-Ⅱ為血腔毒力活性峰。
　　 非還原性SDS-PAGE圖譜和還原性SDS-PAGE顯示，殺蟲蛋白經(jīng)過分子篩和離子柱分離純化后，在分子量50 kDa附近有一明顯蛋白條帶，表明該蛋白只有一個亞基。根據(jù)非