稻曲病菌毒素的分離鑒定及高效產(chǎn)毒菌株的篩選.pdf

1、近年來，由稻曲病菌引發(fā)的稻曲病已成為水稻生產(chǎn)中存在的主要病害，嚴(yán)重影響了水稻產(chǎn)量和品質(zhì)安全。稻曲病菌不但危害水稻穗部形成稻曲球，造成水稻產(chǎn)量降低，并且可產(chǎn)生對(duì)動(dòng)植物具有毒害作用的稻曲病菌毒素。目前，針對(duì)稻曲病菌毒素的相關(guān)研究也逐漸引起重視，然多集中于稻曲球水提物對(duì)動(dòng)植物毒性的研究，而關(guān)于稻曲病菌毒素的分離鑒定、檢測(cè)分析及病原菌產(chǎn)毒研究較少。鑒此，本研究以稻曲球?yàn)樵希诟叻直婕夹g(shù)的鑒定分析基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究了利用液相色譜分離技術(shù)分離純化稻

2、曲病菌毒素的方法；隨之開發(fā)建立了HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定大米中5種稻曲病菌毒素的定量定性分析方法，并將上述研究成果應(yīng)用于高產(chǎn)毒菌株的篩選，初步發(fā)現(xiàn)水分和光照與毒素的產(chǎn)量密切相關(guān)。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　1、借助高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（HPLC-LTQ/Orbitrap MS）技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)Ustiloxin A、Ustiloxin B、Ustiloxin C、Ustiloxin D和Ustiloxin F5種毒素均存在于稻曲球

3、中。以水為提取試劑勻漿提取，混合陽離子交換柱PCX凈化，采用Xselect HSS T3色譜柱分離，進(jìn)行質(zhì)譜掃描，結(jié)合準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)和同位素相對(duì)豐度進(jìn)行質(zhì)譜分析，并通過進(jìn)一步驗(yàn)證二級(jí)質(zhì)譜碎片離子確認(rèn)5種毒素，從而解決了在缺乏相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品情況下難以對(duì)其分析的難題。
　　2、借助液相色譜分離系統(tǒng)制備獲得5種稻曲病菌毒素，經(jīng)HPLC色譜分析各自純度均>88％。以稻曲球?yàn)樵?，物料?:5水提制得樣品提取液，經(jīng) PCX小柱凈化濃縮

4、后，采用半制備-C18色譜柱串聯(lián)CS17離子交換柱液相分離系統(tǒng)進(jìn)行制備。該方法解決了缺乏稻曲病菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品的難題，為后續(xù)相關(guān)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　3、開發(fā)了高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定稻米中5種稻曲病菌毒素的定量定性分析方法。針對(duì)稻米樣品基質(zhì)具有增強(qiáng)毒素基質(zhì)效應(yīng)的問題，選取PCX小柱為樣品凈化材料，在3個(gè)添標(biāo)水平下回收率為77.2%~105.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%~19.0%。5種毒素在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)

5、系數(shù)大于0.99。利用建立的方法檢測(cè)分析5種毒素，表現(xiàn)出峰形良好、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，從而可滿足稻米樣品檢測(cè)稻曲病菌毒素的需要，為科學(xué)、客觀的對(duì)稻曲病污染稻米質(zhì)量安全及開展相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作提供了技術(shù)支撐。
　　4、采用組織分離法從稻曲球中分離純化出多株稻曲病菌菌株，利用高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)不同菌株的液體發(fā)酵液和固體發(fā)酵物進(jìn)行測(cè)定，從而篩選獲得了高產(chǎn)稻曲病菌毒素的菌株 Y-2，考察水分和光照對(duì)菌株產(chǎn)毒規(guī)律影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，大米培養(yǎng)基中水分過