稻曲病菌的侵染機(jī)制研究.pdf

1、稻曲病已發(fā)展成為我國(guó)水稻的三大病害之一,不僅引起水稻產(chǎn)量損失,還產(chǎn)生毒素污染谷物,對(duì)我國(guó)糧食安全及食品安全造成嚴(yán)重威脅。隨著稻曲病人工接種技術(shù)的改善,國(guó)內(nèi)外對(duì)稻曲病菌的侵染機(jī)制進(jìn)行了大量研究,極大地提高了對(duì)稻曲病菌侵染的認(rèn)識(shí)。本研究使用GFP標(biāo)記的菌株接種感病水稻品種晚秈98,在接種后逐日觀察病菌的侵染進(jìn)程及水稻各花器的發(fā)育情況,對(duì)稻曲病菌的侵染機(jī)制進(jìn)行了探討,同時(shí)對(duì)侵染階段的稻曲病菌效應(yīng)子進(jìn)行了鑒定,最后評(píng)價(jià)了種子帶菌不是稻曲病的主要

2、初侵染來源,取得了如下研究結(jié)果:
　　(1)使用GFP標(biāo)記的菌株G2接種感病水稻品種晚秈98,在接種后逐日觀察稻曲病菌的侵染進(jìn)程及水稻各花器的發(fā)育情況,初步揭示了稻曲病菌對(duì)水稻的侵染是一種逐步侵染模式。使用體視熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡,分別觀察到稻曲病菌在水稻花器發(fā)育成熟前通過內(nèi)外穎殼的縫隙進(jìn)入谷粒,首先侵染水稻花絲,隨后侵入柱頭和花柱,偶爾能通過花柱到達(dá)子房。病菌侵染過程中,沒有觀察到吸器、侵染釘?shù)惹秩窘Y(jié)

3、構(gòu),且病菌只在寄主細(xì)胞間隙中生長(zhǎng)。KI-I2染色試驗(yàn)和DAPI染色試驗(yàn)證明被侵染的水稻小穗中花粉發(fā)育明顯受到抑制,子房受精受阻,無法繼續(xù)發(fā)育且不能被KI-I2染色。然而,實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示水稻中一些灌漿相關(guān)基因包括bZIP轉(zhuǎn)錄因子、淀粉代謝相關(guān)基因和種子儲(chǔ)藏蛋白基因在稻曲病菌侵染后被大量誘導(dǎo)表達(dá),表現(xiàn)出與子房受精后類似的表達(dá)模式,表明病菌阻止水稻受精的同時(shí),能模擬水稻的受精,以便獲取水稻營(yíng)養(yǎng)形成稻曲球。使用G2接種溫敏雄性不育系品種

4、Hua9s,在接種后第3d用晚秈98的花粉對(duì)接種的稻穗進(jìn)行人工授粉,探究病菌與受精子房之間的競(jìng)爭(zhēng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)授粉以后的子房都能繼續(xù)發(fā)育成幼嫩的種子,表明稻曲病菌無法與成功受精的子房競(jìng)爭(zhēng),闡釋了稻曲病菌侵入水稻小穗后首先侵染花絲,抑制花粉成熟的原因。本研究揭示的稻曲病菌逐步侵染模式以及病菌模擬水稻受精來劫持營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)形成稻曲球的方式,代表了一種較新穎的病原菌與植物互作的生物學(xué)過程。
　　(2)對(duì)水稻晚秈98接種稻曲病菌后第1d、

5、5d和9d的樣品,以及相應(yīng)對(duì)照用PSB接種的樣品,共6個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。在3個(gè)侵染時(shí)期分別鑒定出89、308和3545個(gè)差異表達(dá)基因,并對(duì)其進(jìn)行了GO富集分析和KEGGPathway富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示接種后第9d,上調(diào)基因主要富集在糖類代謝過程和一些調(diào)控相關(guān)過程。KEGG Pathway富集分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要富集在糖類代謝和能量代謝這兩大類,其中參與糖酵解和糖異生途徑的差異表達(dá)基因在接種后第5d和第9d同時(shí)

6、顯著上調(diào)表達(dá)。另外,水稻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsSWEET家族中大部分基因在病菌侵染后都有不同程度的上調(diào)表達(dá),尤其是接種后第9d,OsSWEET1a、OsSWEET1b、OsSWEET4、OsSWEET、OsSWEET6a、OsSWEET14、OsSWEET16和OsSWEET11-like都顯著上調(diào)表達(dá)。選取OsSWEET5作進(jìn)一步的研究,利用酵母單雜交技術(shù)篩選到3個(gè)與OsSWEET5啟動(dòng)子互作的稻曲病菌效應(yīng)子Uv33、Uv46和Uv48,對(duì)候

7、選效應(yīng)子的轉(zhuǎn)錄組分析表明它們?cè)诘厩【秩具^程中大量表達(dá)。此外,用酵母單雜交試驗(yàn)對(duì)效應(yīng)子Uv33、Uv46和Uv48與OsSWEET5啟動(dòng)子的互作進(jìn)行了體內(nèi)驗(yàn)證。為了驗(yàn)證候選效應(yīng)子是否具有分泌功能,采用pSUC2酵母分泌系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)肽分泌功能驗(yàn)證,結(jié)果表明效應(yīng)子Uv33、Uv46和Uv48的信號(hào)肽具有分泌功能。
　　(3)為了研究種子帶菌是否是稻曲病的一種主要初侵染來源,在2014、2015和2017年分別使用藥劑多菌靈、三唑酮、

8、福美雙和生石灰對(duì)被田間稻曲球污染的水稻種子進(jìn)行處理,隨后在水稻苗期、分蘗期和孕穗期分別對(duì)水稻各組織取樣,用稻曲病菌特異性PCR檢測(cè)樣品中是否攜帶稻曲病菌,并且在水稻成熟期調(diào)查田間稻曲病的發(fā)生情況。在苗期對(duì)水稻的芽和根進(jìn)行PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)處理組與對(duì)照組相比,稻曲病菌的檢測(cè)率顯著降低。然而,在水稻分蘗期對(duì)葉片、莖和根進(jìn)行PCR檢測(cè),以及孕穗期分別對(duì)葉片、莖、穗和根進(jìn)行PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)各處理之間沒有顯著差異,最后在水稻成熟期的田間稻曲病調(diào)查分