IL-34調(diào)控FLS在RA發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)屬于慢性進(jìn)展性的自身免疫病，主要特征是滑膜增生、軟骨及骨組織破壞，具體發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。目前認(rèn)為可能與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)紊亂、滑膜過(guò)度增生、侵潤(rùn)及T細(xì)胞亞群分化失衡有關(guān)。白細(xì)胞介素34(Interleukin34，IL-34)是2008年發(fā)現(xiàn)的一種具有維系巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞生存、發(fā)育及活化功能的細(xì)胞因子，主要通過(guò)與集落刺激因子-1受體(colony stimulation

2、 factor-1 receptor, CSF-1 R)結(jié)合而發(fā)揮作用。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清和關(guān)節(jié)滑液中IL-34的含量均高于正常人，并且與RF及抗CCP抗體呈正相關(guān)?；こ衫w維細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的重要角色，其表面表達(dá)高水平CSF-1R，提示IL-34可能通過(guò)與其表面受體結(jié)合而調(diào)控FLS的功能，從而參與了疾病的發(fā)病過(guò)程。
　　目的:本研究旨在探索IL-34在

3、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病和進(jìn)展中所起的作用，并深入研究IL-34通過(guò)調(diào)控FLS細(xì)胞參與RA發(fā)病過(guò)程的具體機(jī)制。
　　方法:收集RA患者外周血并分離出血清，酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)RA患者及健康對(duì)照血清IL-34水平;評(píng)估IL-34水平與臨床各個(gè)指標(biāo)的關(guān)系。分離培養(yǎng)RA患者FLS，培養(yǎng)至4～6代利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定FLS在培養(yǎng)中的純度，并檢測(cè)FLS表面IL-34受體

4、(CSF-1R)表達(dá)水平;在分離培養(yǎng)的FLS中加入重組IL-34刺激，蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞上清液中不同細(xì)胞因子的分泌;增加FLS細(xì)胞株數(shù)，反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription，RT-PCR)及ELISA法驗(yàn)證蛋白芯片結(jié)果，檢測(cè)IL-34刺激前后及加入IL-34受體拮抗劑后細(xì)胞中IL-6，Cox-2的mRNA表達(dá)水平及細(xì)胞培養(yǎng)上清的IL-6，PGE2的分泌;提取FLS總RNA，RT-PCR檢測(cè)caspase8 mRNA

5、表達(dá)水平，觀(guān)察IL-34對(duì)FLS凋亡的影響，MTT法檢測(cè)IL-34刺激后的細(xì)胞增殖;提取FLS總蛋白，Western blot檢測(cè)FLS胞內(nèi)Erk-1/2、JNK-1/2/3、P38、NF-κB通路的活化，并用相應(yīng)的信號(hào)通路抑制劑處理FLS，加入IL-34刺激后RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中IL-6，Cox-2的mRNA表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清的IL-6，PGE2的分泌;體外分離健康人PBMC，磁珠分選法分離出CD4+T細(xì)胞，流式

6、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分離后CD4+T細(xì)胞百分率，需95％以上方可用于實(shí)驗(yàn)中;將分離純化好的CD4+T細(xì)胞，與RA患者FLS以直接接觸或transwell體系共培養(yǎng)，體系中加入CD3/CD28或CD3/CD28及IL-34，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17百分率;ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)上清IL-6水平;向RA患者FLS與健康人外周血分離出的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入IL-6受體拮抗劑，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17百分率。
　　結(jié)果:RA患者血清中IL-3

7、4水平較健康對(duì)照相比顯著升高;RA患者血清IL-34的含量與ESR、CRP、RF、抗CCP抗體水平均呈正相關(guān);RA患者FLS表面高表達(dá)IL-34受體(CSF-1R)，重組IL-34可顯著促進(jìn)RA患者FLS細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，尤其是IL-6、PGE2、ENA-78、IL-8、GRO及MCP-1;重組IL-34還可以促進(jìn)FLS的增殖，抑制其凋亡;CSF-1R拮抗劑可抑制FLS細(xì)胞分泌IL-6、PGE2等因子;western blot結(jié)果顯

8、示IL-34刺激后的FLS胞內(nèi)p-ERK-1/2、p-P38、p-JNK-1/2/3及p-NF-κB顯著增多，總ERK-1/2、P38、JNK-1/2/3及NF-κB不變;使用P38、JNK-1/2/3及NF-κB抑制劑處理FLS后，IL-34促進(jìn)IL-6生成被明顯抑制，P38及NF-κB抑制劑可明顯降低PGE2的表達(dá);從健康人外周血中分離獲得的PBMC中，CSF-1R僅在單核細(xì)胞表面可檢測(cè)到，T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞活化及非活化狀態(tài)下均

9、不表達(dá)CSF-1R; RA患者FLS與健康人CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，加入抗CD3/CD28抗體或抗CD3/CD28抗體/IL-34刺激后的共培養(yǎng)體系中Th17的產(chǎn)生在直接接觸與transwell體系下無(wú)明顯差異;加入抗CD3/CD28抗體/IL-34可顯著促進(jìn)共培養(yǎng)體系中Th17的數(shù)量增加及共培養(yǎng)體系中IL-6的分泌，且IL-6水平較單獨(dú)IL-34刺激FLS分泌的IL-6水平顯著升高;IL-6受體拮抗劑可顯著抑制共培養(yǎng)體系中Th17