葡萄籽原花青素和褪黑激素對(duì)缺氧性肺動(dòng)脈高壓的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　缺氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是一種常見呼吸系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為肺血管阻力的增加，肺血管結(jié)構(gòu)重建，肺動(dòng)脈壓力的進(jìn)行性升高。到目前為止，臨床上還沒有能夠根治肺動(dòng)脈高壓的確切的治療方法，HPH已成為目前亟待研究并予以解決的一項(xiàng)重大難題?；钚匝?reactive oxygenspecies，ROS)在HPH病理發(fā)展過程中的重要作用日益受到人們的關(guān)注。長(zhǎng)期處于低氧狀態(tài)下

2、會(huì)引發(fā)缺氧誘導(dǎo)動(dòng)物模型的肺組織及肺動(dòng)脈中產(chǎn)生大量ROS，而一些類似抗氧化酶的化合物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明對(duì)HPH具有良好的治療作用。因此，清除由低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的過量ROS可作為治療HPH的一種有效方法。葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extract，GSPE)是從葡萄籽中提取的天然多酚類化合物。GSPE是迄今發(fā)現(xiàn)的植物來源的最高效的抗氧化劑之一，具有廣泛的抗自由基和氧化應(yīng)激的生理學(xué)及藥理學(xué)活性。并且G

3、SPE在心血管諸多疾病中的保護(hù)及治療作用已得到廣泛證實(shí)。雖然GSPE已被證明具有清除ROS活性及心血管保護(hù)作用，然而GSPE對(duì)HPH是否具有抑制作用目前尚無相關(guān)報(bào)道。本課題將通過建立缺氧性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型來初步研究GSPE對(duì)HPH的抑制作用及其可能機(jī)制。
　　目的:
　　通過觀察葡萄籽原花青素對(duì)缺氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的肺動(dòng)脈壓力的變化，右心室肥厚程度及肺血管結(jié)構(gòu)重建的影響，探討葡萄籽原花青素對(duì)缺氧性肺動(dòng)脈高壓的治療作用及

4、其可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.缺氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的建立及分組。
　　28只雄性Sprague-Dawley大鼠(200-250g)隨機(jī)分成4組，每組7只:①常氧組;②常氧給予GSPE組;③低氧組;④低氧給予GSPE組。第②和第④組大鼠在實(shí)驗(yàn)前1周及實(shí)驗(yàn)4周連續(xù)給予GSPE(每日250mg/kg)灌胃。
　　2.大鼠肺動(dòng)脈血液動(dòng)力學(xué)及組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)。
　　將大鼠低氧處理4周后，經(jīng)右心室插入導(dǎo)管檢測(cè)右

5、心室平均收縮壓力(RVSP)。取出大鼠心臟，分離出右心室(RV)，左心室+室間隔(LV+S)，計(jì)算其比值(RV/LV+S)作為右心室肥厚指標(biāo)。大鼠肺組織經(jīng)多聚甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色。用Image Pro Plus病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量肺動(dòng)脈外徑、內(nèi)徑、中膜面積、血管面積，并計(jì)算中膜厚度(WT％)及面積(WA％)百分比以代表肺動(dòng)脈增厚程度。
　　3.大鼠肺組織免疫組化染色。
　　大鼠肺組織經(jīng)固定、包埋后利用α-肌動(dòng)蛋白

6、(α-SMA)抗體及PCNA抗體進(jìn)行免疫組化染色。
　　4.測(cè)定肺組織及血清中的丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量。
　　5.原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)及分組。
　　利用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)，并取3至6代用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分成6組:常氧組;低氧組;低氧+20μg/ml GSPE組;低氧+40μg/mlGSPE組;低氧+80μg/ml GSPE組;以及低氧+120μg/mlGSP

7、E組。
　　6.檢測(cè)各組PASMCs中的ROS含量。
　　將細(xì)胞在常氧或低氧條件下培養(yǎng)12小時(shí)后，利用DCFH-DA探針及流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組PASMCs中的ROS含量。
　　7.利用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PASMCs在低氧條件下的增生情況以及葡萄籽原花青素對(duì)PASMCs增生的抑制作用。
　　8.應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組PASMCs中的p-STAT3、cyclin D1，以及cyclin D3蛋白的表達(dá)

8、情況。
　　9.應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組大鼠肺組織及PASMCs中的NOX4 mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.低氧組大鼠RVSP、RV/LV+S、WT％，以及WA％明顯高于常氧組及常氧+GSPE組大鼠，然而低氧+GSPE組大鼠RVSP、RV/LV+S、WT％，以及WA％均明顯低于單純低氧組大鼠。
　　2.通過Image-Pro Plus圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析顯示，低氧組大鼠肺動(dòng)脈α-SMA光

9、密度值明顯高于常氧組及常氧+GSPE組大鼠，而低氧+GSPE組大鼠肺動(dòng)脈α-SMA光密度值則明顯低于單純低氧組大鼠肺動(dòng)脈α-SMA光密度值。
　　3.低氧組大鼠肺組織及血清中的SOD含量較常氧組及常氧+GSPE組明顯降低，而MDA含量則明顯增高。在給予GSPE治療后，大鼠肺組織及血清中的SOD含量明顯增高，而MDA含量則明顯降低。
　　4.在體外實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與常氧組相比較，低氧組PASMCs內(nèi)的ROS含量

10、明顯升高，然而低氧+GSPE組PASMCs內(nèi)的ROS含量較低氧組明顯降低。
　　5.低氧組大鼠肺組織及低氧組PASMCs中的NOX4 mRNA水平較常氧組大鼠肺組織及常氧組PASMCs明顯增高，而低氧+GSPE組大鼠肺組織及低氧+GSPE組PASMCs中的NOX4 mRNA水平較低氧組大鼠肺組織及低氧組PASMCs明顯降低。
　　6.低氧組大鼠肺動(dòng)脈中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于常氧組及常氧+GSPE組大鼠肺動(dòng)脈中PCNA陽(yáng)性

11、細(xì)胞數(shù)。另外，與常氧組相比較，低氧明顯促進(jìn)了低氧組PASMCs的增生。在給予GSPE治療后，不但低氧組大鼠肺動(dòng)脈中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，低氧+GSPE組PASMCs的增生明顯受到了抑制。
　　7.與常氧組相比較，低氧組PASMCs的p-STAT3、cyclin D1以及cyclin D3的蛋白表達(dá)明顯升高，低氧+GSPE組PASMCs的p-STAT3、cyclin D1以及cyclin D3的蛋白表達(dá)較低氧組明顯下降。