麋鹿角水溶性蛋白質(zhì)部位及其活性評價研究.pdf

1、麋鹿角為鹿科動物麋鹿（Elaphurus davidianus Milne Edwards）的骨化角，是傳統(tǒng)補益類中藥，其具有壯腎陽、填精髓、強筋骨、益精血等傳統(tǒng)功效。研究發(fā)現(xiàn)，麋鹿角水提液具有抗衰老與補陽的作用。因此，水溶性物質(zhì)可能是麋鹿角的功效物質(zhì)，麋鹿角水溶性物質(zhì)主要含有蛋白質(zhì)及多肽類、氨基酸、核苷類、氨基己糖等。然而，目前關(guān)于麋鹿角物質(zhì)基礎(chǔ)研究主要集中于無機(jī)元素、氨基酸等物質(zhì)的分析，作為在生命活動中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)類、多肽類

2、物質(zhì)研究尚少。本論文以麋鹿角作為研究對象，對麋鹿角中水溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化，進(jìn)而研究其細(xì)胞活性。
　　1.麋鹿角水溶性蛋白的分離與鑒定
　?。?）麋鹿角水溶性蛋白的分離
　　采用中空纖維膜技術(shù)對麋鹿角蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，共得到四個不同分子量段：MW>100 kDa（ML2，0.17 g/g生藥），10 kDa

3、g生藥），MW<3 kDa（ML5，0.046 g/g生藥）；根據(jù)其極性的大小、分子量的大小等不同的特點，本實驗采用陰離子交換色譜法（DEAE Sepharose Fast Flow）對超濾所得的組分ML2-ML5進(jìn)一步分離，獲得7個分子量段麋鹿角蛋白質(zhì)J1-J7。
　?。?）麋鹿角水溶性蛋白的鑒定
　　采用Nano LC-IT Orbitrap與PEAKS軟件相結(jié)合的方法，在麋鹿角水溶性提取物 ML1中共鑒定出360個肽段

4、，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，其中216個肽段來源于97個蛋白質(zhì)，其余144個肽段僅以從頭測序方法鑒定；在ML2中共鑒定出185個肽段，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，其中85個肽段來源于6個蛋白質(zhì)，其余100個肽段僅以從頭測序方法鑒定；ML3共鑒定出310個肽段，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，其中158個肽段來源于11個蛋白質(zhì)，其余152個肽段僅以從頭測序方法鑒定；ML4共鑒定出541個肽段，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，其中148個肽段來源于34個蛋白質(zhì)，其余393個肽段僅以從頭測序方法鑒定；M

5、L5共鑒定出577個肽段，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，其中370個肽段來源于72個蛋白質(zhì)，其余207個肽段僅以從頭測序方法鑒定；J1共鑒定出440個肽段，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，其中236個肽段來源于264個蛋白質(zhì)，其余204個肽段僅以從頭測序方法鑒定；J2共鑒定出396個肽段，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，其中162個肽段來源于301個蛋白質(zhì)，其余234個肽段僅以從頭測序方法鑒定；J3共鑒定出455個肽段，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，其中193個肽段來源于253個蛋白質(zhì)，其余202個肽段

6、僅以從頭測序方法鑒定；J4共鑒定出709個肽段，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，其中27個肽段來源于206個蛋白質(zhì)，其余682個肽段僅以從頭測序方法鑒定；J5共鑒定出581個肽段，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，其中93個肽段來源于277個蛋白質(zhì)，其余488個肽段僅以從頭測序方法鑒定；J6共鑒定出462個肽段，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，其中241個肽段來源于382個蛋白質(zhì)，其余221個肽段僅以從頭測序方法鑒定；J7共鑒定出375個肽段，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，其中86個肽段來源于249個蛋白質(zhì)

7、，其余289個肽段僅以從頭測序方法鑒定。
　　2.麋鹿角水溶性蛋白的生物活性評價研究
　　（1）麋鹿角水溶性蛋白對成骨分化功能的功效評價研究
　　本實驗采用MTT法，對麋鹿角水溶性蛋白對大鼠成骨細(xì)胞osteoblasts的促增殖活性初步篩選。結(jié)果表明，ML1（總水提取物）、ML2（MW>100000）、ML3（10000

8、000　　ML1、ML4、ML5對大鼠成骨細(xì)胞中COL1A1和Rat osteonectin mRNA的表達(dá)均有不同程度的提高，其中ML4對COL1A1和Rat osteonectin mRNA的表達(dá)

9、作用效果最明顯；J1、J3、J5對大鼠成骨細(xì)胞（osteoblasts）中COL1A1和osteonectin mRNA的表達(dá)量與對照組相比無顯著差異，J2、J4、J6、J7對大鼠成骨細(xì)胞中COL1A1和Rat osteonectin mRNA的表達(dá)均有不同程度的提高，其中J6對COL1A1和Rat osteonectin mRNA的表達(dá)作用效果最明顯。
　　（2）麋鹿角水溶性蛋白對神經(jīng)營養(yǎng)因子的功效評價研究
　　本實驗基于

10、 qPCR技術(shù)分析了馬鹿角總水提物及麋鹿角水溶性蛋白ML1-ML5，J1-J7對大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6周期信號通路上關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄蛋白的影響。研究發(fā)現(xiàn)麋鹿角總水提物（ML1）與馬鹿角總水提物相比，麋鹿角對各關(guān)鍵轉(zhuǎn)入蛋白mRNA的表達(dá)作用效果較明顯。ML2-ML5，J1-J7對大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的關(guān)鍵轉(zhuǎn)入蛋白BDNF、NGF、GDNF mRNA的表達(dá)均有不同程度的提高，其中ML5對各關(guān)鍵轉(zhuǎn)入蛋白mRNA的表達(dá)作用效果最明顯，經(jīng)純化后的J1-

11、J7蛋白樣品中，J5對各關(guān)鍵轉(zhuǎn)入蛋白mRNA的表達(dá)作用效果最明顯。
　?。?）麋鹿角水溶性蛋白對免疫活性的功效評價研究
　　本論文使用小鼠脾細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，研究麋鹿角水溶性蛋白 ML1-ML5， J1-J7對小鼠脾細(xì)胞的增殖作用，結(jié)果表明，麋鹿角水溶性蛋白ML2，即分子量為MW>100000的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出明顯的脾細(xì)胞增殖作用。濃度最高為0.3 mg/mL時，增殖效果可達(dá)135%，結(jié)果表明麋鹿角水溶性蛋白對免疫細(xì)胞具有一定的