加減薯蕷丸對血管性癡呆大鼠海馬ERK5-BMK1信號通路的調(diào)節(jié)作用及機制研究.pdf

1、目的：探討血管性癡呆（vascular dementia，VD）的病機和治法；探索VD發(fā)生發(fā)展過程中神經(jīng)再生的“腎精虧虛”病機生物學(xué)基礎(chǔ)，分析“加減薯蕷丸”（補腎生髓益智法）對VD發(fā)生發(fā)展的防治效應(yīng)及作用機制。
　　方法：
　　1、理論研究：
　　查閱相關(guān)文獻(xiàn)，從中醫(yī)基礎(chǔ)理論“腎藏精”理論入手，結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)辨治VD的研究進展，探討VD的基本病機和治法；溯源“加減薯蕷丸”，結(jié)合前期研究成果分析“加減薯蕷丸”對VD的作用機

2、理。
　　2、實驗研究：
　　120只SPF級健康成年Wistar雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字法分為4組：①正常對照組（下稱正常組）：Wistar雄性大鼠20只，不予手術(shù)，在造模后第三天開始，予灌胃生理鹽水10ml/kg/d×8周。②假手術(shù)組：Wistar雄性大鼠20只，予頸部局部皮膚切開，并分離出頸總動脈后，既不結(jié)扎也不剪斷，暴露5分鐘直接縫合皮膚。造模后第三天開始，予灌胃生理鹽水10ml/kg/d×8周。③VD模型

3、組（下稱模型組）：造模（改良2-VO法）后進行行為學(xué)篩查，將符合VD表現(xiàn)的大鼠隨機均分為兩組（模型組和加減薯蕷丸組），造模后第三天開始，予灌胃生理鹽水10ml/kg/d×8周。④加減薯蕷丸組（下稱治療組）：分組方法同模型組，造模后第三天開始，予灌胃加減薯蕷丸10ml/kg/d×8周。記錄大鼠一般狀態(tài)；分別統(tǒng)計不同時間節(jié)點大鼠死亡數(shù)，計算大鼠存活率，Log-rank法統(tǒng)計大鼠生存曲線；用Morris水迷宮大鼠進行行為學(xué)檢測；HE染色光鏡下

4、觀察大鼠海馬病理切片；TUNEL熒光染色后光鏡下觀察大鼠海馬細(xì)胞凋亡的情況；采用免疫組織化學(xué)方法觀察ERK5/BMK1上游信號因子（MEKK2、MEKK3、MEK5）及ERK5的表達(dá)；運用Western blot法檢測MEKK2、MEKK3、MEK5、ERK5蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、理論探討：
　　“腎精虧虛”是VD的基本病機：腎精虧虛是VD的發(fā)生根本。腎精虧虛可生痰、瘀，痰、瘀反過來又使腎虛更甚，最終形成“虛

5、虛實實”的惡性循環(huán)。腎虛、痰瘀互相影響，互為因果，既是VD發(fā)生的前提，亦為VD發(fā)展變化的內(nèi)在動力。所以，在辨治VD時，雖說“腎精虧虛”是VD的基礎(chǔ)，亦當(dāng)重視補腎填精益智與健脾化痰通竅、養(yǎng)血活血通絡(luò)并舉以攻頑疴。
　　對VD的治療可從補腎立法：通過中醫(yī)“補腎”法治療VD的肯定療效，結(jié)合采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)進行研究的國內(nèi)外相關(guān)研究成果，提示腦的功能與腎密切相關(guān)，且腦的虛性病變常治以“補腎”。
　　加減薯蕷丸治療VD的機理分析：加減薯

6、蕷丸是由《金匱要略》中的“薯蕷丸”化裁而來，具有“補腎生髓益智”功效；導(dǎo)師研究團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)，加減薯蕷丸在干預(yù)認(rèn)知障礙方面取得了很好的臨床療效，并且從行為學(xué)、病理學(xué)及分子生物學(xué)等方面一定程度的揭示了VD發(fā)生發(fā)展的病理機制及過程。
　　2、實驗結(jié)果：
　　2.1各組大鼠一般狀態(tài)：
　　正常組：整個實驗過程毛發(fā)、口唇、指甲、眼珠、精神及食欲等一般情況良好。
　　模型組：造模前，實驗大鼠毛發(fā)、口唇、指甲、眼珠、精

7、神及食欲等一般情況良好。造模后，出現(xiàn)不同程度的毛色枯暗、唇甲紫暗、精神萎靡而活動變少、睡眠增多而食欲下降；部分大鼠出現(xiàn)不同程度的眼瞼下垂、眼裂減小及眼球輕度凹陷；個別老鼠出現(xiàn)腹部逐漸脹滿如球狀，伴明顯的進食和排便減少，毛色粗糙無光澤，四肢逐漸消瘦而死亡等。經(jīng)過一段時間喂養(yǎng)或藥物灌胃后，一般情況較造模后有所改善。與正常組和假手術(shù)組比較，一般情況差。假手術(shù)組：術(shù)前，實驗大鼠毛發(fā)、口唇、指甲、眼珠、精神及食欲等一般情況良好。術(shù)后3天內(nèi)出現(xiàn)程度

8、不等的毛色枯暗、精神萎靡而活動變少，其余一般情況良好。隨著正常飼養(yǎng)，一般情況基本恢復(fù)。與正常組比較差異不明顯。
　　治療組：造模前，實驗大鼠毛發(fā)、口唇、指甲、眼珠、精神及食欲等一般情況良好。造模后，出現(xiàn)不同程度的毛色枯暗、唇甲紫暗、精神萎靡而活動變少、睡眠增多而食欲下降；部分大鼠出現(xiàn)不同程度的眼瞼下垂、眼裂減小及眼球輕度凹陷；個別老鼠出現(xiàn)腹部逐漸脹滿如球狀，伴明顯的進食和排便減少，毛色粗糙無光澤，四肢逐漸消瘦而死亡等。經(jīng)過一段時間

9、喂養(yǎng)或藥物灌胃后，一般情況較造模后有所改善。與假手術(shù)組比較，一般情況不良；與模型組比較，一般情況良。
　　2.2各組大鼠存活情況：
　　各組動物存活情況進行Log-rank（Mantel-Cox）檢測，p＜0.05，存在統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果詳見圖1。
　　接受模型構(gòu)建的大鼠在造模后7天（灌胃前），存活率為87.1％。
　　從生存曲線來看，模型組大鼠在造模術(shù)后7天（灌胃前）、造模后灌胃2周和灌胃4周的存活率分別為94.

10、44%、85.86%和85.86%；假手術(shù)組上述各存活率維持在96.00%；治療組上述各存活率分別為95.96%、89.96%和77.11%。
　　2.3 Morris水迷宮檢測結(jié)果：
　　定位航行實驗結(jié)果顯示：不同時間點逃避潛伏期比較，造模后7天（灌胃前），模型組（116.47±6.99）和治療組（116.89±5.44）的平均逃避潛伏期均高于假手術(shù)組（94.85±13.47）；造模后灌胃4周，治療組（89.92±3.20

11、）低于模型組（117.00±5.64）；造模后灌胃8周，治療組（87.15±12.74）低于模型組（117.54±5.05）；以上數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，均存在顯著性差異，P＜0.05。
　　空間探索實驗結(jié)果顯示：不同時間點平均跨越平臺次數(shù)比較，造模后7天（灌胃前），模型組（3.15±0.12）和治療組（2.89±0.09）的平均跨越平臺次數(shù)均低于假手術(shù)組（8.20±0.21）；治療組在造模后灌胃4周（4.16±0.18）明顯高于造模后

12、7天（灌胃前）；造模后灌胃8周，治療組（6.21±0.25）高于模型組（3.52±0.23）；以上數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，均存在顯著性差異，P＜0.01或P＜0.05。
　　2.4海馬神經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)觀察結(jié)果
　　正常組：椎體細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)完成、輪廓清晰，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，核仁清楚。
　　模型組：椎體細(xì)胞稀疏，排列松散不規(guī)則，細(xì)胞間距增寬，椎體細(xì)胞體積變小，核體積變小，染色加深，核仁欠清晰，部分細(xì)胞壞死。
　　假手

13、術(shù)組：椎體細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)完成、輪廓清晰，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，核仁清楚。
　　治療組：與模型組比較椎體細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞密度增加，細(xì)胞形態(tài)完整、輪廓較清晰，核體積增大，核仁比較清楚，較模型組差別明顯。
　　2.5熒光染色的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡結(jié)果
　　采取TUNEL熒光染色后光鏡下觀察，凋亡細(xì)胞呈綠色。
　　各時間點細(xì)胞凋亡情況如下：造模后7天（灌胃前）：模型組（120.35±29.24）較假手術(shù)組（23.22±

14、12.35）細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加；造模后灌胃4周，治療組（85.74±25.49）比模型組（123.59±27.24）細(xì)胞凋亡數(shù)明顯低；造模后灌胃8周，治療組（54.86±23.59）比模型組（130.76±30.08）細(xì)胞凋亡數(shù)顯著降低；以上數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，均存在顯著性差異，P＜0.01或P＜0.05。
　　2.6大鼠MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5蛋白表達(dá)結(jié)果（免疫組織化學(xué)）
　　各組MEKK2表達(dá)水平的比較：

15、造模后灌胃4周，治療組（2.1250±0.2830）高于模型組（0.6000±0.4083），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.01。
　　各組MEKK3表達(dá)水平的比較：造模后灌胃8周，模型組（0.3542±0.3753）低于假手術(shù)組（0.8333±0.6986），差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。
　　各組MEK5表達(dá)水平的比較：造模后灌胃4周，治療組（1.800±0.1375）高于模型組（0.6000±0.2819），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)

16、分析，P＜0.05；造模后灌胃8周，治療組（1.2368±0.5482）高于模型組（0.5100±0.3389），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05。
　　2.7 MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5蛋白表達(dá)（western blot）
　　各組MEKK3表達(dá)水平的比較：造模后灌胃8周，模型組（0.3312±0.2790）低于假手術(shù)組（0.5721±0.4345），治療組（0.5787±0.3650）高于模型組（0.3312±

17、0.2790）；以上數(shù)據(jù)經(jīng)處理，存在明顯差異，P＜0.05。
　　各組MEK5表達(dá)水平的比較：造模后灌胃4周，模型組（0.1927±0.1100）低于假手術(shù)組（0.4521±0.2666），治療組（0.3928±0.2766）高于模型組（0.1927±0.1100），以上數(shù)據(jù)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析， P＜0.05。
　　結(jié)論：
　　通過理論研究，深入探討VD的病因病機，提示“腎精虧虛”是VD的基本病機，“補腎法”可以有效改善V

18、D的臨床癥狀，加減薯蕷丸在VD發(fā)生基礎(chǔ)為“腎精虧虛、痰瘀阻絡(luò)”的理論指導(dǎo)下，可以治療VD的相關(guān)癥狀。
　　改良2-VO模型提高了模型動物的存活率，且模型病變特點符合VD模型特點，通過本模型，可以深入探討VD的發(fā)生機制。
　　模型組發(fā)生的大鼠生存狀態(tài)、行為學(xué)改變、海馬組織結(jié)構(gòu)改變以及下調(diào)MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5蛋白的表達(dá)，使ERK5/BMK1信號通路下調(diào)，抑制海馬神經(jīng)元的再生，這可能是大腦缺氧缺血后發(fā)生VD或

19、者加重VD進程的重要分子機制之一。
　　加減薯蕷丸改善了VD大鼠的生存狀態(tài)，改善了VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，改善了海馬組織結(jié)構(gòu)紊亂情況，減少了海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，并較模型組明顯上調(diào)了ERK5特異上游蛋白MEK5的表達(dá)，從而激活了ERK5/BMK1信號通路，促進海馬神經(jīng)元的再生，這可能是加減薯蕷丸治療VD的作用機制之一。
　　加減薯蕷丸通過抑制ERK5/BMK1信號通路下調(diào)促進海馬神經(jīng)元的再生及修復(fù)可能是其發(fā)揮治療VD作用的生物學(xué)