加減薯蕷丸對(duì)血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)重構(gòu)干預(yù)的研究.pdf

1、[目的]神經(jīng)重構(gòu)是血管性癡呆（Vascular dememtia,VD）發(fā)生及維持的重要機(jī)制，包括神經(jīng)元丟失、神經(jīng)膠質(zhì)增生、軸突及樹突重構(gòu)、突觸聯(lián)系紊亂及變性等。本課題通過研究加減薯蕷丸對(duì)VD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡與炎癥的干預(yù)，探索加減薯蕷丸減少海馬椎體元丟失及預(yù)防神經(jīng)重構(gòu)的作用；研究加減薯蕷丸對(duì)VD大鼠海馬神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中少突膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞增生干預(yù)及促進(jìn)神經(jīng)纖維再生的作用，探索其對(duì)VD神經(jīng)膠質(zhì)及神經(jīng)纖維重構(gòu)的干預(yù)；研究加減薯蕷丸對(duì)

2、VD大鼠海馬神經(jīng)突觸的保護(hù)并促進(jìn)突觸重建作用，探索其增強(qiáng)神經(jīng)突觸聯(lián)系，預(yù)防突觸重構(gòu)的作用。從干預(yù)神經(jīng)重構(gòu)的三個(gè)方面的作用進(jìn)一步探討加減薯蕷丸對(duì) VD的治療及改善智能的機(jī)制。
　　[方法]選取SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，分為假手術(shù)組、模型組與藥物組三組。模型組與藥物組采用改良雙血管阻斷法制備VD模型，假手術(shù)組除不阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈外余操作同手術(shù)組。手術(shù)一周后藥物組以加減薯蕷丸濃縮制劑（由湖北省中醫(yī)院制劑室制備，劑量按1ml/100g體

3、重）灌胃治療45天，另兩組以生理鹽水灌胃，劑量、療程同藥物組。記錄三組大鼠在術(shù)前、術(shù)后與取材前體重變化，觀察大鼠精神、飲食、進(jìn)水等情況。以水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（包括定位航行實(shí)驗(yàn)與空間探索實(shí)驗(yàn)）評(píng)定三組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，對(duì)大鼠海馬取材，取新鮮海馬組織以進(jìn)行電鏡觀察及RT-PCR檢測(cè)；取灌注海馬組織以進(jìn)行HE染色與免疫組化染色。HE染色重點(diǎn)觀察大鼠海馬CA1區(qū)組織改變，包括椎體細(xì)胞層、輻射層、腔隙層、及多形細(xì)胞層改變;

4、免疫組化測(cè)定海馬 CA1區(qū)Bax、Bcl-2與NF-κB以分析VD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡與炎癥調(diào)控，反應(yīng)神經(jīng)保護(hù)與預(yù)防神經(jīng)重構(gòu)；檢測(cè)Olig-2、GFAP以分析少突膠質(zhì)細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞增生情況以反映海馬神經(jīng)膠質(zhì)重構(gòu)；檢測(cè)SYP、PSD-95、MAP-2分析海馬突觸蛋白改變以研究突觸生成、突觸破壞與重建;采用RT-PCR分析海馬組織GAP-43mRNA表達(dá)以進(jìn)一步研究神經(jīng)再生與突觸重建的基因調(diào)控；采用透射電鏡重點(diǎn)觀察突觸超微結(jié)構(gòu)的改變。<

5、br>　　[結(jié)果]一般情況觀察：在改良2-VO手術(shù)結(jié)束后，手術(shù)組大鼠進(jìn)食、進(jìn)水明顯減少，精神差、活躍程度明顯低下、嗜睡等現(xiàn)象。一周后體重比假手術(shù)組明顯下降（F值：19.535，P：0.000），術(shù)后經(jīng)過2周左右的康復(fù)及喂養(yǎng)，手術(shù)組快速恢復(fù)，在進(jìn)食、飲水等方面明顯增多，經(jīng)過45天的飼養(yǎng)，在取材當(dāng)天稱重，三組體重已無差異（F值：0.010，P：0.990）。
　　水迷宮實(shí)驗(yàn)中，各組逃避潛伏期及逃避距離在實(shí)驗(yàn)最初兩天相互間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

6、，第三天開始，假手術(shù)組逃避距離及逃避潛伏期與模型組相比下降較多，達(dá)到顯著性差異（P<0.05）。第四天藥物組逃避距離及逃避潛伏期下降較快，與假手術(shù)組接近，二者與模型組相比達(dá)到顯著性差異（P<0.05, P<0.05）。在空間搜索實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，假手術(shù)組及藥物組跨越平臺(tái)次數(shù)均較模型組多，達(dá)到顯著性差異（P<0.01及P<0.05）、平臺(tái)所在象限游行時(shí)間及游行距離多，達(dá)到顯著性差異（P<0.05及P<0.01）。三組總游行距離及速度沒

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　HE染色觀察：假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列3-5層，層次分明，相鄰細(xì)胞排列整齊致密，細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)紅染，胞核大而圓，核仁清晰。輻射層呈較規(guī)則的輻射狀排列，膠質(zhì)細(xì)胞較少，可見呈圓形核的少突膠質(zhì)細(xì)胞。分子層排列致密，細(xì)胞間腔隙較少。模型組海馬CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞排列紊亂稀疏，椎體細(xì)胞分1-3層，細(xì)胞形態(tài)不完整，胞漿內(nèi)可見空泡，細(xì)胞核深染、固縮，呈三角形或不規(guī)則形，核仁不明顯，部分細(xì)胞核消失。輻射層明顯疏松，極

8、性紊亂，延續(xù)到分子層和腔隙層。腔隙層纖維錯(cuò)亂，縫隙較多較大?？梢娔z質(zhì)細(xì)胞增生。藥物組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列較為整齊，椎體細(xì)胞明顯增多，排列5-7層，結(jié)構(gòu)相對(duì)正常。輻射層致密，排列較規(guī)整。分子層及腔隙層可見大量椎體細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞增生。
　　RT-PCR測(cè)定GAP-43mRNA表達(dá)來看，假手術(shù)組表達(dá)最低，模型組較之明顯升高，達(dá)到極顯著性差異（P<0.01）。而藥物組進(jìn)一步升高，與假手術(shù)組及模型組相比均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01及P<

9、0.05）。
　　免疫組化結(jié)果：1.凋亡及炎癥指標(biāo)：Bax表達(dá)：模型組最高，與藥物組及假手術(shù)組相比均達(dá)到極顯著性差異（P﹤0.01, P<0.01）；假手術(shù)組最低，與藥物組相比達(dá)到極顯著性差異（P﹤0.01）。Bcl-2：藥物組Bcl-2表達(dá)最高，與假手術(shù)組及模型組相比均達(dá)到極顯著性差異(P﹤0.01, P<0.01）；假手術(shù)組Bcl-2表達(dá)比模型組高，達(dá)到極顯著性差異（P﹤0.01）。NF-κB：藥物組和假手術(shù)組均明顯低于模型組

10、，達(dá)到極顯著性差異（P﹤0.01），藥物組高于假手術(shù)組，達(dá)到顯著性差異（P﹤0.05）。
　　2.神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生指標(biāo)：Olig-2表達(dá):假手術(shù)組表達(dá)最多，藥物組次之，二者與模型組相比達(dá)到極顯著性差異（P﹤0.01, P<0.01）；藥物組與假手術(shù)組相比達(dá)到顯著性差異（P﹤0.05）。模型組表達(dá)最低。GFAP表達(dá)：假手術(shù)組最低，與另外兩組相比均有極顯著性差異(P﹤0.01, P<0.01）；藥物組次之，與模型組相比達(dá)到極顯著性差異

11、（P﹤0.01）；模型組表達(dá)最高。
　　3.突觸相關(guān)蛋白表達(dá)：MAP-2表達(dá)：藥物組及假手術(shù)組高于模型組，達(dá)到顯著性差異（P﹤0.01， P﹤0.05）。藥物組高于假手術(shù)組，達(dá)到極顯著性差異（P﹤0.01）；SYP表達(dá)：藥物組表達(dá)明顯高于模型組及假手術(shù)組，達(dá)到極顯著性差異（P﹤0.01, P<0.01）；假手術(shù)組也明顯高于模型組（P﹤0.01）；PSD-95表達(dá)：藥物組及假手術(shù)組明顯高于模型組，達(dá)到極顯著性差異（P﹤0.01, P

12、<0.01）；藥物組最高，與假手術(shù)組相比，也達(dá)到極顯著性差異（P﹤0.01）。
　　突觸的電鏡觀察：假手術(shù)組：突觸間隙清晰，突觸前后膜輪廓完整。突觸小泡較多，突觸曲面規(guī)則，突觸前后膜吻合良好，后膜可見明顯增厚。線粒體完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上核糖體較多。模型組：突觸間隙模糊，突觸前后膜腫脹，空化。難以區(qū)分突觸前后膜。突觸小泡減少，線粒體固縮，較少。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒。藥物組：突觸前后膜結(jié)構(gòu)完整。突觸間隙清晰可見，突觸小泡較多，線粒體結(jié)構(gòu)完整，含量豐