聯(lián)合調控PPARγ及CGRP基因表達預防酒精性股骨頭壞死的實驗研究.pdf

1、背景：
　　酒精性股骨頭壞死是骨科常見病，發(fā)病率有逐年增加的趨勢。該病多見于中青年，且多為雙側發(fā)病，未經(jīng)有效治療者將發(fā)生股骨頭塌陷，關節(jié)功能損毀，致殘率極高，嚴重影響患者的生活質量。股骨頭塌陷患者最終需要進行人工關節(jié)置換手術，手術效果對于年輕患者來說尚不確定，早期行人工關節(jié)置換將不可避免地行翻修術，經(jīng)濟成本較大，增加患者家庭與經(jīng)濟負擔，且并發(fā)癥多、遠期療效不能肯定，可見該病不僅給病人增加極大痛苦，還引發(fā)一系列社會問題。
　　

2、研究發(fā)現(xiàn)酒精可誘導骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）內過氧化物酶體增殖子活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)基因的高表達，誘導股骨頭髓腔內干細胞的成脂分化，促進其向脂肪細胞發(fā)展，并因脂類物質沉積而引發(fā)股骨頭內高壓，同時成骨分化能力減弱，最終發(fā)生股骨頭壞死。抑制或阻斷PPARγ基因的表達則抑制其成

3、脂分化，保持成骨分化的特點，減少股骨頭壞死的發(fā)生率。降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)為一種調節(jié)骨組織生長代謝的神經(jīng)肽基因，可促進骨髓干細胞的增殖能力和成骨活性，與骨代謝和修復密切相關。因此，通過聯(lián)合調控PPARγ基因和CGRP基因的表達，抑制骨髓干細胞的成脂分化，同時主動增強其成骨分化的能力成為預防酒精性股骨頭壞死新的研究方向。
　　目的：
　　通過構建能夠沉默PP

4、ARγ，同時表達CGRP的雙基因重組載體，觀察聯(lián)合調控PPARγ基因和CGRP基因的表達對酒精誘導下兔BMSCs成脂、成骨分化能力的影響；采用致敏法與酒精灌胃法制作兔酒精性ONFH模型，將雙基因重組載體轉染的BMSCs植入動物模型股骨頭內，觀察其對酒精性股骨頭壞死的預防效果，對預防股骨頭壞死的進一步研究提供新的實驗基礎。本研究分為以下三個部分：
　　第一部分、沉默PPARγ表達CGRP基因重組載體的構建與鑒定
　　方法：

5、r>　　（1）發(fā)卡樣siRNA（shRNA）寡核苷酸鏈的設計與合成：按照siRNA片段的設計原則，依據(jù)GenBank中PPARγ的基因序列，篩選并合成合成2條PPARγsiRNA寡核苷酸鏈，3'和5'端分別加入BamHⅠ和HindⅢ的酶切殘基，并在設計時改變BamHⅠ酶切位點的一個堿基。
　?。?）兔CGRP基因完整ORF克?。呵捌诘玫酵肅GRP基因完整ORF克隆，設計其兩端帶MluI酶切位點，與TGFP融合蛋白表達單元間用一段柔

6、性鏈連接。
　　（3）重組載體的構建：發(fā)卡樣 siRNA寡核苷酸靶序列退火后克隆入線性化pGFP-V-RS載體，得到沉默PPARγ的沉默載體pGFP-V-RS-siPPARγ；CGRP基因ORF cDNA純化后與線性化pGFP-V-RS載體連接，得到表達CGRP的表達載體pGFP-V-RS-exCGRP；CGRP ORF cDNA片段克隆入沉默載體pGFP-V-RS-siPPARγ，得到沉默PPARγ、表達CGRP雙基因載體pGF

7、P-V-RS-siPPARγ-exCGRP。
　　結果：
　　經(jīng)酶切和DNA測序鑒定正確，三種重組載體構建成功，為進一步觀察雙基因重組載體對酒精誘導下BMSCs成脂、成骨分化的影響提供實驗基礎。
　　第二部分、聯(lián)合調控PPARγ及CGRP基因表達對酒精誘導兔骨髓間充質干細胞分化的影響
　　方法：
　?。?）密度梯度離心法獲取兔BMSCs，流式細胞儀行表面抗原CD29，CD34、CD44、CD45、CD105

8、鑒定。
　?。?）應用BTX ECM2001電轉儀系統(tǒng)將重組載體分別電轉入BMSCs中，并在需要酒精誘導的各組中加入酒精，終濃度均保持在0.09mol/L，同時設立對照組。MTT法檢測各組細胞增殖情況。細胞培養(yǎng)7天、14天時，TaqMan RT-PCR和Western blot檢測PPARγ、CGRP、Runx2、osteocalcin mRNA及蛋白的表達。細胞培養(yǎng)14天檢測各組細胞內甘油三酯含量、堿性磷酸酶（ALP）活性、培養(yǎng)

9、基中骨鈣素含量、層粘連蛋白含量、I型膠原含量，并行 ALP染色。細胞培養(yǎng)21天，行油紅“O”脂肪染色。
　　結果：
　?。?）流式細胞儀檢測表面標志物結果顯示，BMSCs表達CD29、CD44、CD105，陽性率分別為99.86％，99.34%，99.65%；CD34、CD45呈陰性，陽性率分別為1.27%，1.45%。得到高純度的BMSCs。
　　（2）酒精誘導下，轉染沉默載體pGFP-V-RS-siPPARγ的BM

10、SCs組中，細胞增殖曲線稍低于正常組，無顯著性變化（P>0.05）；PPARγ、Runx2和Osteocalcin mRNA及蛋白的表達與正常組中接近，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；細胞中甘油三酯含量、ALP活性、培養(yǎng)基中骨鈣素含量、層粘連蛋白含量、I型膠原含量與正常組接近，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。實驗第14天時，ALP染色結果顯示，部分細胞胞漿染色為藍/紫色，與Normal組接近。實驗第21天，細胞中沒有脂滴發(fā)現(xiàn)或極少發(fā)

11、現(xiàn)，油紅“O”脂肪染色結果顯示，細胞中極少有橘紅色脂滴發(fā)現(xiàn)。
　?。?）轉染表達載體pGFP-V-RS-exCGRP的BMSCs組中，細胞增殖曲線稍低于Normal組，無顯著性變化（P>0.05）；能穩(wěn)定表達CGRP mRNA及蛋白；PPARγmRNA及蛋白的表達、細胞中甘油三酯含量高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Runx2和Osteocalcin mRNA及蛋白的表達、細胞中ALP活性、培養(yǎng)基中骨鈣素含量、層粘連蛋

12、白含量、I型膠原含量稍低于正常組，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。實驗第14天時，ALP染色結果顯示，部分細胞胞漿染色為藍/紫色，與Normal組接近。實驗第21天，細胞中可以見到大小不一的圓形脂滴，表現(xiàn)為折光較強的圓形黑色顆粒環(huán)，油紅“O”脂肪染色結果顯示，細胞中可見大量橘紅色脂滴形成。
　　（4）轉染雙基因載體pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP的BMSCs組中，細胞增殖曲線與正常組基本一致，無顯著性變化（P>0

13、.05）。能穩(wěn)定表達CGRP mRNA及蛋白；PPARγ mRNA、蛋白的表達及細胞內甘油三酯的含量得到有效抑制，與正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；Runx2和Osteocalcin mRNA及蛋白的表達量、ALP活性、培養(yǎng)基中骨鈣素含量、層粘連蛋白含量、I型膠原含量均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。實驗第14天時，ALP染色結果顯示，大量細胞胞漿染色為藍/紫色，較正常組多。實驗第21天，細胞中沒有脂滴發(fā)現(xiàn)或

14、極少發(fā)現(xiàn)，油紅“O”脂肪染色結果顯示，細胞中極少有橘紅色脂滴發(fā)現(xiàn)。
　　第三部分、聯(lián)合調控PPARγ及CGRP基因表達預防兔酒精性ONFH的動物實驗研究
　　方法：
　?。?）動物模型的制作：取健康新西蘭大耳白兔80只，隨機平均分組為5組，每組16只。按10ml/kg劑量經(jīng)兔耳緣靜脈行馬血清注射，3周后再次注射馬血清致敏，劑量同前。2周后10ml/(kg·d)的烈性白酒(體積分數(shù)為46%的乙醇)灌胃，此時作為實驗第0天

15、，并于實驗的第1、3、6周的第一天，用特制骨髓穿刺針在股骨頭頸交界處向一側股骨頭內鉆約0.5cm的針孔，微量注射器取轉染有重組載體的BMSCs25μl隨機注入實驗動物一側股骨頭內，骨蠟堵閉穿刺孔道。分別于實驗的第4、8周末分批處死實驗動物。
　　（2）實驗分組：1、實驗組（S組）：馬血清致敏完成后烈性白酒10ml/(kg·d)灌胃，并向一側股骨頭內注射轉染有雙基因載體 pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP的BMSCs。

16、2、空載體組（Con組）：馬血清致敏完成后烈性白酒10ml/(kg·d)灌胃，并向一側股骨頭內注射轉染有空載體pGFP-V-RS的BMSCs。3、模型組（M組）：馬血清致敏完成后烈性白酒10ml/(kg·d)灌胃。4、致敏組（H組）：僅行馬血清致敏。（5）空白對照組（N組）：空白對照。
　?。?）組織形態(tài)學的觀察：取出股骨頭并沿冠狀面將其剖開，行蘇丹Ⅲ脂肪染色及 HE染色，分別對以下指標進行檢測：1、骨壞死發(fā)生率2、骨小梁面積分數(shù)

17、3、空骨陷窩計數(shù)4、最大脂肪細胞平均直徑。
　?。?）成脂及成骨分化相關基因的檢測：TaqMan Real Time-PCR檢測PPARγ、CGRP、Runx2、osteocalcin mRNA；Western blot檢測PPARγ、CGRP、Runx2、osteocalcin蛋白。
　　結果：
　?。?）實驗動物股骨頭組織形態(tài)學變化：酒精灌胃8w時，M組和Con組的骨小梁變細，稀疏、中斷、排列紊亂，骨小梁面積明顯減

18、少；股骨頭軟骨下區(qū)骨髓內的脂肪組織明顯增多，脂肪細胞增大，有的融合成泡，造血組織明顯減少，桔紅色的脂質充滿軟骨下區(qū)的骨細胞及骨髓腔內。這些病理變化在N組、H組和S組中并未發(fā)現(xiàn)。
　?。?）實驗第4周時M組和Con組的空骨陷窩計數(shù)較N組增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；H組和S組中的空骨陷窩計數(shù)與N組中接近，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。實驗第8周時，M組和Con組中最大脂肪細胞平均直徑、空骨陷窩計數(shù)較N組明顯增加，骨小梁

19、面積分數(shù)較N組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；S組及H組中最大脂肪細胞平均直徑、空骨陷窩計數(shù)以及骨小梁面積分數(shù)與N組相比無明顯差異（P>0.05）。
　?。?）PPARγ、CGRP、 Runx2、Osteocalcin mRNA和蛋白表達檢測結果：實驗第4、8周，M組與Con組股骨頭骨髓細胞內PPARγmRNA和蛋白呈高表達，與N組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），CGRP、Runx2及osteocalcin mRNA

20、和蛋白呈低表達，與N組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。S組中PPARγ mRNA和蛋白表達量與N組接近，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），CGRP、Runx2及osteocalcin mRNA和蛋白呈高表達，與N組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；H組中PPARγ、CGRP、Runx2及osteocalcin mRNA和蛋白表達量與N組接近，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　結論：
　?。?）成功構建三種調控

21、PPARγ和CGRP基因的重組載體：能夠沉默PPARγ基因的沉默載體pGFP-V-RS-siPPARγ；能夠表達CGRP基因的表達載體pGFP-V-RS-exCGRP；能夠沉默 PPARγ，同時表達CGRP的雙基因載體pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP，經(jīng)酶切鑒定和DNA測序完全正確。
　?。?）沉默PPARγ表達CGRP的雙基因重組載體能有效阻斷酒精誘導的BMSCs內PPARγ mRNA和蛋白的表達，抑制細胞的成脂

22、分化，同時增加了BMSCs的成骨相關基因及蛋白的表達，增強了其成骨分化的能力。
　　（3）通過聯(lián)合調控PPARγ及CGRP基因的表達，可顯著減少酒精誘導的兔股骨頭內脂肪物質的堆積，同時增強了股骨頭內BMSCs的成骨分化能力，促進骨組織的修復和重建，有效預防了酒精性股骨頭壞死的發(fā)生。
　?。?）本實驗利用靶向PPARγsiRNA和CGRP基因共同構建雙基因重組載體，并轉染入BMSCs，通過阻斷PPARγ基因，高效阻止細胞成脂分