“易層”貼敷膏對兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨與滑膜MMPs及上游NF-κB信號通路的影響.pdf

1、目的:
　　基于“易層”貼敷膏治療膝骨性關(guān)節(jié)的臨床療效，觀察其對IL-1β、MMP-1、MMP-13及TIMP-1表達的影響，并探討“易層”貼敷膏與介導(dǎo)炎癥的NF-kB信號通路的相關(guān)性，闡明“易層”貼敷膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的靶向作用及機制。
　　方法:
　　實驗一:以健康的，骨骼成熟的新西蘭大白兔30只，雌雄各半，體質(zhì)量(2.5±0.1)kg，稱重后隨機分為3組:正常組、模型對照組和治療組，每組10只;適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，

2、制備兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，造模成功后6周，治療組予以“易層”貼敷膏外用于膝關(guān)節(jié)表面皮膚，每日給藥一次，連續(xù)2周?？瞻捉M及模型對照組均不給藥。2周后處死所有動物，取兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織，Western Blot法檢測MMP-1及MMP-13蛋白表達水平，RT-PCR法檢測IL-1β、MMP-1及MMP-13基因表達水平。
　　實驗二:以健康的，骨骼成熟的新西蘭大白兔30只，雌雄各半，體質(zhì)量(2.5±0.1)kg，稱重后隨機分為3組:正常組

3、、模型對照組和治療組，每組10只;適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，制備兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，造模成功后6周，治療組予以“易層”貼敷膏外用于膝關(guān)節(jié)表面皮膚，每日給藥一次，連續(xù)2周?？瞻捉M及模型對照組均不給藥。2周后處死所有動物，取兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織，番紅O染色觀察軟骨表面，Western Blot法檢測MMP-1、MMP-13及TIMP-1蛋白表達水平，RT-PCR法檢測IL-1β、MMP-1、MMP-13及TIMP-1基因表達水平。
　　實驗三:以

4、健康的，骨骼成熟的新西蘭大白兔30只，雌雄各半，體質(zhì)量(2.0±0.1)kg，稱重后隨機分為3組:正常組、模型對照組和治療組，每組10只;適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，制備兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，造模成功后6周，治療組予以“易層”貼敷膏外用于膝關(guān)節(jié)表面皮膚，每日給藥一次，連續(xù)2周。空白組及模型對照組均不給藥。2周后處死所有動物，取兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織，WesterBlot法檢測軟骨組織TLR-4、NF-kB p65蛋白表達水平，RT-PCR法檢測軟骨組織T

5、LR-4、NF-κ B p65基因表達水平。
　　結(jié)果:
　　實驗一:Western Blot結(jié)果顯示:模型組中 MMP-1蛋白含量高于治療組(P＜0.05)，正常組中MMP-1含量最低(P＜0.05)。各組MMP-13蛋白含量之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，模型組含量最高，空白組含量最低。RT-PCR結(jié)果顯示:各組滑膜中MMP-1的基因表達量通過Kruskal-Wallis H法檢驗，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，其中

6、模型對照組中表達量最高，正常組最低;各組MMP-13基因表達量采用單因素方差分析(ANOVA)，治療組滑膜美中MMP-13基因表達明顯低于模型對照組(P＜0.05)，但高于正常組(P＜0.05);滑膜各組IL-1β基因表達選擇單因素方差分析(ANOVA)，正常組女 IL-1β表達明顯低于模型對照組及治療組(P＜0.01)，模型對照組與治療組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　實驗二:組織學(xué)染色結(jié)果:正常組、模型組及治療組軟骨標(biāo)本石蠟切片，番紅

7、O染色后，參考Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)進行評估，模型組評分顯著高于正常組(P＜0.01)，治療組評分明顯低于模型組(P＜0.01)。Western Blot法結(jié)果顯示:模型組中 MMP-1含量高于治療組(P＜0.05)，正常組中MMP-1含量最低(P＜0.01);模型組MMP-13含量明顯高于治療組和正常組(P＜0.01)，治療組中TIMP-1的含量明顯高于模型組與正常組，之間存在統(tǒng)計學(xué)差異。RT-PCR結(jié)果顯示:模型組中MMP-1及MMP

8、-13表達量顯著高于正常組(P＜0.01)，治療組MMP-1及MMP-13表達量明顯低于模型組(P＜0.05);各組軟骨組織中TIMP-1表達量比較發(fā)現(xiàn)，治療組中TIMP-1的表達量明顯高于模型組(P＜0.01);各組間IL-1β表達未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　實驗三:Western Blot結(jié)果顯示:模型組軟骨組織中TLR4、NF-κ B p65的含量明顯高于空白組(P＜0.01)，治療組中TLR-4、NF-κ B p65蛋白含量

9、明顯低于模型組(P＜0.01)。治療組中NF-κ B p65蛋白含量與空白組無明顯差異(P＞0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義。RT-PCR結(jié)果顯示:模型組軟骨組織中TLR-4、NF-kB p65基因含量明顯高于空白組(P＜0.01)，治療組中NF-kB p65基因含量低于模型組(P＜0.05)，治療組中TLR-4基因含量明顯低于模型組(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　“易層”貼敷膏能下調(diào)模型兔滑膜及軟骨組織中MMP-1及MMP-1

10、3的含量;降低模型兔滑膜及軟骨組織中MMP-1及MMP-13的基因的表達，同時，使用“易層”貼敷膏治療后增加了TIMP-1的生成，也抑制了MMPs的分泌，恢復(fù)MMPs/TIMP-1的動態(tài)平衡。由此可見，“易層”貼敷膏能減少軟骨細胞外基質(zhì)的降解，對軟骨基質(zhì)有保護作用。此外，“易層”貼敷膏對NF-kB信號通路上游及關(guān)鍵物質(zhì)蛋白及基因表達均具有一定的抑制作用，而這一結(jié)果與藥物臨床運用的表現(xiàn)是相符合的。但實驗中發(fā)現(xiàn)其未明顯改變IL-1β的基因的