miR-221-222對(duì)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的激活及其對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的影響機(jī)制研究.pdf

1、本文分為兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 miR-221/222作用于PTEN發(fā)揮對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的調(diào)控作用
　　目的：研究miR-221/222在不同人多發(fā)性骨髓瘤（MM）細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)情況及其靶向作用于PTEN，從而發(fā)揮對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：采用qRT-PCR法檢測(cè)人MM細(xì)胞系NCI-H929、U266、OPM-2、MM.1S、MM.1R、RPMI8226、

2、ARH-77等多個(gè)細(xì)胞系miR-221/222的表達(dá)情況；設(shè)計(jì)合成miR-221/222特異性模擬物miR-221/222 mimics和特異性抑制物miR-221/222 inhibitor，對(duì)miR221/222低表達(dá)細(xì)胞系（MM.1S）以及高表達(dá)細(xì)胞系（OPM-2等）分別轉(zhuǎn)染miR-221/222 mimics/inhibitor，實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組、正常對(duì)照組、miR-221/222 mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染組；

3、qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-221/222表達(dá)量；PI3K活性定量檢測(cè)法檢測(cè)PI3K活性變化；Western blot檢測(cè)AKT、mTOR及p-AKT和p-mTOR蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）miR-221/222在OPM-2細(xì)胞系中高表達(dá)，MM.1S細(xì)胞系中低表達(dá)；（2）miR-221/222 mimics能在不影響其它非編碼小RNA表達(dá)的情況下有效的上調(diào)miR-221/222在細(xì)胞系MM.1S中的表達(dá)量；miR-221

4、/222 inhibitor則能有效的下調(diào)miR-221/222在MM.1R和OPM-2細(xì)胞系中的表達(dá)量；（3）上調(diào)miR-221/222后，PI3K活性、p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，總AKT和mTOR的表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化；（4）相反，下調(diào)miR-221/222的表達(dá)量后，PI3K活性及p-AKT和p-mTOR表達(dá)明顯下調(diào)，總AKT和mTOR表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：異常過(guò)表達(dá)的miR-221/222可通過(guò)靶向作

5、用于PTEN基因從而上調(diào)PI3K活性，進(jìn)而使下游AKT和mTOR的磷酸化水平上調(diào)，通過(guò)拮抗該異常表達(dá)的miR-221/222可降低PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的磷酸化水平。
　　第二部分 miR-221/222靶向作用于PTEN發(fā)揮對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路調(diào)控及其多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的凋亡與周期影響
　　目的：利用表達(dá)/拮抗試驗(yàn)觀(guān)察在人MM細(xì)胞系中不同miR-221/222表達(dá)情況對(duì)MM細(xì)胞凋亡及周期的影響，并

6、進(jìn)一步探討其機(jī)制。
　　方法:設(shè)計(jì)合成miR-221/222特異性模擬物miR-221/222 mimics和特異性抑制物miR-221/222 inhibitor，用miR-221/222 mimics轉(zhuǎn)染MM.1S使其miR-221/222的表達(dá)水平上調(diào)，以及miR-221/222 inhibitor轉(zhuǎn)染 MM.1R使其miR-221/222表達(dá)水平下調(diào)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組、正常對(duì)照組、miR-221/222 mimics

7、/inhibitor轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后給予藥物（雷帕霉素）；qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-221/222表達(dá)量；PI3K活性定量檢測(cè)法檢測(cè)PI3K活性變化情況；Western blot檢測(cè)miR-221/222表達(dá)量對(duì)AKT、mTOR等信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的影響；利用CCK-8檢測(cè)miR-221/222表達(dá)量對(duì)MM細(xì)胞系的增殖影響；采用Annexin VFITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-221/222過(guò)表達(dá)或抑制對(duì)MM細(xì)

8、胞凋亡的影響；采用碘化丙啶（PI）單染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-221/222過(guò)表達(dá)量對(duì)MM細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果：（1）下調(diào)miR-221/222的表達(dá)可以明顯抑制MM.1R細(xì)胞增殖能力，能誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡，并促其向S期轉(zhuǎn)變；（2）上調(diào)miR-221/222的表達(dá)后能促進(jìn)MM.1S細(xì)胞的增殖，減少其凋亡,并誘導(dǎo)其向G0/G1期轉(zhuǎn)變；（3）下調(diào)miR-221/222聯(lián)合PI3K/AKT/mTOR通道抑制劑（雷帕霉素）作用于MM細(xì)

9、胞系可以更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并且能夠減低藥物的IC50；（4）雷帕霉素不僅可以作為mTOR的抑制劑，同時(shí)也可以抑制PI3K的活性，從而誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡；
　　結(jié)論：沉默miR-221/222的表達(dá)能夠抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，使其磷酸化水平降低，從而抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及阻滯細(xì)胞周期，最終抑制骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；此外，下調(diào)miR-221/222表達(dá)水平能減低抗MM藥物的IC50，從而避免大劑