高糖作用下大鼠海馬神經元MLCK表達與MAPK-ERK通路的相關性及二苯乙烯苷對神經元保護作用機制的探討.pdf

1、目的：建立SD大鼠海馬神經元細胞原代培養(yǎng)模型，確定最適的高糖作用濃度和作用時間；檢測高糖作用下海馬神經元細胞內ERK、p-ERK和MLCK的表達；探討高糖環(huán)境下海馬神經元細胞MLCK與MAPK/ERK信號通路的相關性；初步研究高糖作用后二苯乙烯苷致MLCK表達下降的作用機制。
　　方法:1.海馬神經元細胞的原代培養(yǎng)及鑒定：以25mM為基礎糖濃度培養(yǎng)海馬神經元細胞，并用倒臵顯微鏡觀察海馬神經元的形態(tài)；細胞培養(yǎng)至第7天，通過NSE免疫

2、組化染色鑒定海馬神經元細胞的純度，并計算海馬神經元細胞的純度；2.最適高糖濃度探索：原代培養(yǎng)海馬神經元細胞，將細胞懸液接種到96孔板中，細胞培養(yǎng)至第5天，將細胞分為25mM-24h組、25mM-48h組、25mM-72h組、45hmM-24h組、45mM-48h組、45mM-72h組；達到各組相應的糖作用時間后，用CCK-8試劑盒檢測各組細胞的OD值，計算各組海馬神經元的活性，得出最適高糖作用濃度。3.最適高糖作用時間的探索：原代培養(yǎng)海

3、馬神經元細胞，將細胞懸液接種到玻底培養(yǎng)皿中，將細胞分為25mM組、45hmM-24h組、45mM-48h組、45mM-72h組；達到各組相應的糖作用時間后，進行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察海馬神經元ERK、p-ERK和MLCK的表達，得出最適高糖作用時間。4.高糖作用后，海馬神經元細胞內ERK、p-ERK和MLCK的表達情況：原代培養(yǎng)海馬神經元細胞，細胞培養(yǎng)至第5天，將細胞分為對照組和高糖組；達到高糖作用的48h后，提取蛋白，B

4、CA蛋白定量后，Western Blot檢測ERK、p-ERK和MLCK的表達，并進行統(tǒng)計學分析。5. p-ERK和MLCK相關性的探討：原代培養(yǎng)海馬神經元細胞，細胞培養(yǎng)至第5天，將細胞分為高糖對照組、ERK抑制劑組和MLCK抑制劑組；其中ERK抑制劑組在高糖作用的同時加入ERK抑制劑PD98059作用24h，MLCK抑制劑組在高糖作用的同時加入MLCK抑制劑作用8h；高糖作用48h后，提取蛋白，BCA蛋白定量后，Western Blo

5、t檢測p-ERK和MLCK的表達，并進行統(tǒng)計學分析。6.二苯乙烯苷對海馬神經元細胞的保護作用：原代培養(yǎng)海馬神經元細胞，細胞培養(yǎng)至第5天，將細胞分為高對照組糖組、二苯乙烯苷低劑量組（TSG-L組TSG濃度為10μmol/L）、二苯乙烯苷中劑量組（TSG-M 組,TSG濃度為50μmol/L）和二苯乙烯苷高劑量組（TSG-H組，TSG濃度為100μmol/L）；各組在高糖作用的同時加入相應濃度的二苯乙烯苷作用24h；高糖作用48h

6、后，提取蛋白，BCA蛋白定量后，Western Blot檢測各組海馬神經元中p-ERK和MLCK的表達，并進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：1.海馬神經元細胞的原代培養(yǎng)及鑒定：海馬神經元細胞接種后6h完全貼壁，生長良好，至7天基本發(fā)育成熟，經鑒NSE染色鑒定細胞純度達90％以上，適合后續(xù)實驗。2.最適高糖濃度的探索：CCK-8結果顯示45mM組培養(yǎng)24h、48h、72h的海馬神經元存活率>80%，屬1級細胞，可用于后續(xù)試驗；60mM組培

7、養(yǎng)24h、48h和72h后，海馬神經元存活率均<80%，不能用于后續(xù)試驗。3.最適高糖作用時間的探索：激光共聚焦觀察海馬神經元發(fā)現，隨著糖濃度的升高，海馬神經元細胞內ERK熒光強度不變（P>0.05），p-ERK和MLCK熒光強度均升高（P<0.05），45mM-48h和45mM-72h組較45mM-24h組升高明顯（P<0.05），但45mM-48h組和45mM-72h組差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。4.高糖作用后，海馬神經元細

8、胞內p-ERK和MLCK的表達情況：Western Blot結果顯示，與對照組相比，ERK表達無明顯變化（P>0.05）,高糖組海馬神經元細胞內p-ERK和MLCK表達明顯升高（P<0.01）；5.高糖作用下，p-ERK與MLCK的關系探討：Western Blot結果顯示，與高糖組相比，MLCK抑制劑組MLCK表達降低（P＜0.01），但p-ERK水平未有明顯變化（P＞0.05）；PD組MLCK表達及p-ERK水平均降低（P＜0.01

9、）,且兩者具有正相關性（r=0.878，P＜0.01）；6.二苯乙烯苷對海馬神經元細胞的保護作用：Western Blot結果顯示，TSG-M組、TSG-H組MLCK表達及p-ERK表達均降低（ P<0.05）， MLCK表達與p-ERK變化水平呈正相關（r=0.829，P＜0.01）。TSG-L組MLCK和p-ERK表達雖降低但差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　結論：1.糖濃度升高時海馬神經元細胞內ERK表達沒有變化，但