LC-MS-MS測定單抗迪諾塞麥方法建立及其在猴體內(nèi)藥代動力學研究中的應(yīng)用.pdf

1、傳統(tǒng)的單抗藥代動力學測定方法為ELISA法，該方法直接、快速、靈敏度高且可用于高通量測定。但其具有測定范圍較窄、精密度差、獲得特異的抗原或抗體周期長以及易受內(nèi)源性物質(zhì)干擾等局限性。因此人們一直在探討新的分析方法，其中將待測蛋白酶解后獲取目標肽段，然后采用LC-MS/MS進行蛋白定量的方法可彌補ELISA方法的缺點，其有較寬的分析范圍、較好的精密度、分析靈敏度高（定量下限可達1 ng/mL）、可進行多組分同時測定，與穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)標和

2、適當?shù)目贵w富集處理過程相結(jié)合使結(jié)果更加準確。本文采用抗人IgG抗體富集法和免疫富集法以LC-MS/MS定量血清中的迪諾塞麥并應(yīng)用于猴體內(nèi)藥代動力學研究。
　　方法的建立：比較研究了抗人IgG抗體富集法和免疫富集法兩種樣品前處理方法捕獲血清中的迪諾塞麥，同時采用100 mM醋酸/水溶液作為蛋白解偶聯(lián)溶液，所得兩種方法的平均絕對提取回收率分別為81.7％和86.9%；解偶聯(lián)后的樣品選用25 mM DTT與50 mMIAA變性，37.5

3、℃過夜酶解，酶解液經(jīng)HLB小柱除鹽，洗脫液經(jīng)濃縮進樣，LC-MS/MS測定。測定選用來自Fc段的16肽VVSVLTVVHQDWLNGK作為檢測肽段；同位素標記的VVSV[L(13C6；15N)]TVVHQDW[L(13C6；15N)]NGK肽段作為內(nèi)標；色譜柱：Poroshell120 EC-C18（2.1×100 mm I.D.，2.7μm粒徑）；梯度洗脫，流動相A為0.1%甲酸/水，B為甲醇；流速：0.45 mL/min；柱溫：50

4、℃；進樣量：5μL。采用電噴霧離子化源（ESI），正離子方式檢測，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（ MRM），目標多肽和同位素內(nèi)標分析離子對分別為 m/z599.0[M+3H]3+/798.4[M+1H]1+，m/z603.3[M+3H]3+/805.3[M+2H]2+。
　　方法學驗證：LC-MS/MS結(jié)合抗人IgG抗體富集法和免疫富集法的線性范圍分別為0.05～20.0μg/mL和0.1~30.0μg/mL；最低定量下限分別為0.05μ

5、g/mL和0.1μg/mL；日間、日內(nèi)精密度分別為3.5%～9.8%和1.9%～14%，日間、日內(nèi)準確度（RE%）分別為-3.3%~-1.2%和-4.7%～-1.6%；提取回收率分別為66.9%～77.8%和65.2%～90.4%；血清樣品室溫放置4 h、反復凍融3次及樣品處理后放置24 h后均穩(wěn)定，由以上結(jié)果可知兩種方法均滿足猴血清中迪諾塞麥的定量分析。
　　猴體內(nèi)藥代動力學研究：應(yīng)用LC-MS/MS對迪諾塞麥在猴體內(nèi)藥代動力學

6、進行評價，根據(jù)所測得的血藥濃度計算得到藥代參數(shù)如下：采用抗人 IgG抗體富集法和免疫富集法測得迪諾塞麥在猴體消除半衰期t1/2（均值±標準差）分別為223.6±53.2 h和196.2±109 h，藥時曲線下面積 AUClast分別為13613.6±2832.8μg·h/mL和11366.9±1022.8μg·h/mL；AUCall分別為16100.7±3189.4μg·h/mL和12348.1±1809.3μg·h/mL；Tmax分別

7、為88.0±14 h和88.0±14 h；Cmax分別為42.7±5.5 ug/mL和30.7±4.9 ug/mL。采用ELISA方法檢測迪諾塞麥在猴體內(nèi)消除半衰期t1/2為185.1±109 h，藥時曲線下面積AUClast為12361.0±1240.1μg·h/mL；AUCall為13378.2±2077.6μg·h/mL；Tmax為88.0±14 h；Cmax為33.4±2.1 ug/mL。以上三種方法所得藥時曲線趨勢相似且抗人I