HPLC法測定內(nèi)源性活性硫方法的建立及其在雄黃、雄黃與甘草次酸聯(lián)合用藥對小鼠體內(nèi)活性硫水平影響研究中的應(yīng)用.pdf

1、活性硫廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞代謝、炎癥反應(yīng)及癌癥等眾多病理生理調(diào)節(jié)過程，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。目前已有的活性硫檢測方法檢測靈敏度較低，特異性較差，因此，建立準(zhǔn)確、高通量的分析方法測定生物樣品中活性硫水平成為研究的重點(diǎn)和焦點(diǎn)。
　　內(nèi)源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)為小分子物質(zhì)，游離H2S是一個(gè)具有兩個(gè)酸解離常數(shù)的弱酸，所以，其在體內(nèi)有兩種存在形式，分別是1

2、/3以H2S氣體分子形式、2/3以硫氫化鈉(NaHS)形式存在，NaHS既是H2S的供體，亦是H2S的生成前體，兩者之間形成一種動(dòng)態(tài)平衡。生物體內(nèi)H2S的存在形式根據(jù)周圍環(huán)境的pH值不同而不同，在生理?xiàng)l件下，約20％的硫化物是H2S形式，當(dāng)pH值為9.5時(shí)，游離H2S則主要以HS-，即活性硫形式存在。
　　雄黃(Realgar)為含砷中藥，具有解毒殺蟲，燥濕祛痰，截瘧的功效。臨床應(yīng)用廣泛，療效顯著，是國務(wù)院在《醫(yī)療用藥毒性藥品管理

3、辦法》中特別規(guī)定的28種毒性中藥之一，臨床上因不規(guī)范（超量或長時(shí)間）服用含雄黃中成藥常導(dǎo)致全身多系統(tǒng)損害，以肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)及皮膚損害為主。目前，氧化應(yīng)激和氧化損傷學(xué)說在慢性砷中毒發(fā)病機(jī)制的研究中已經(jīng)得到普遍認(rèn)可。近年來研究表明，甘草次酸(Glycyrrhetinic Acid，GA)具有抗腫瘤、抗炎抗菌、抗病毒、抗心血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝細(xì)胞、抗氧化及腎上腺皮質(zhì)激素樣作用等多方面的藥理作用和生物學(xué)活性，能明顯增強(qiáng)肝腎的解毒功能

4、和腦保護(hù)作用，且甘草對雄黃有一定的解毒作用。
　　目的：
　　本研究建立了溴甲烷柱前衍生化-高效液相色譜-紫外檢測法(MBB-HPLC-UV)檢測生物樣品中活性硫水平的方法，探討各組織器官中活性硫?qū)π埸S的敏感程度，及甘草次酸對雄黃的解毒作用，為進(jìn)一步闡明雄黃所致藥源性毒性作用物質(zhì)基礎(chǔ)的研究及早期預(yù)防提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)為中成藥中甘草與雄黃的配伍機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部

5、提供SPF級雄性ICR小鼠70只，體重20±2 g。正式實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按照體重分層隨機(jī)分為7組，每組10只。以0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液為混懸介質(zhì)，第1組為對照組（0.5％ CMC-Na水溶液），第2～4組為低、中、高劑量雄黃染毒組，分別灌胃給予雄黃混懸液0.15 g/kg、0.45 g/kg、1.35 g/kg，第5組為甘草次酸對照組，灌胃給予甘草次酸48 mg/kg，第6～7組為甘草次酸低、高劑量干預(yù)組，分

6、別灌胃給予甘草次酸(16 mg/kg)+雄黃(1.35 g/kg)、甘草次酸(48 mg/kg)+雄黃(1.35 g/kg)。灌胃每日1次，每隔3天稱量體重1次，調(diào)節(jié)灌胃容量，染毒8周。最后一次灌胃24 h后，無水乙醚麻醉，眼眶取血，冰浴下取大腦，心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及睪丸組織，預(yù)冷0.9％生理鹽水沖洗干凈待用。
　　第一部分實(shí)驗(yàn):MBB柱前衍生化-HPLC-UV法測定生物樣品中活性硫含量方法的建立與方法學(xué)確證。
　

7、　第二部分實(shí)驗(yàn):采用MBB柱前衍生化-HPLC-UV法測定雄黃及其與甘草次酸聯(lián)合用藥小鼠血漿、腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及睪丸中活性硫含量。
　　所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析與處理，用單因素方差分析方法(ANOVA)進(jìn)行各指標(biāo)組間差異的顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05作為檢驗(yàn)的顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　方法學(xué)考察結(jié)果顯示，小鼠血漿、腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及睪丸中活性硫衍生物與其他內(nèi)源性化合

8、物分離良好，活性硫衍生物的保留時(shí)間為13.00 min。血漿、腦、睪丸中活性硫在1～30μmol/L范圍內(nèi)，心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟中活性硫在3～60μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。方法中活性硫衍生物日內(nèi)、日間精密度的RSD值分別小于8.5％和8.0％，準(zhǔn)確度的RE在-10％～10％范圍內(nèi)，回收率在90％～110％范圍內(nèi)，符合有關(guān)的規(guī)范要求。同時(shí)，各組織樣品中活性硫衍生物在室溫放置8h、經(jīng)3次凍融循環(huán)，-70℃冷凍7天后穩(wěn)定性良好，

9、表明該方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠、檢出限低。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，活性硫在小鼠體內(nèi)各臟器分布水平由高到低順序?yàn)樾呐K＞肝臟名腎臟＞腦＞脾臟＞睪丸＞肺臟，以心臟中活性硫水平最高，肺臟中活性硫水平最低。
　　比較各雄黃組組織中活性硫含量的結(jié)果表明，與對照組相比，雄黃染毒1.35g/kg組血漿、腦、肝臟及腎臟中活性硫水平顯著降低(P＜0.05)，色譜圖中活性硫的MBB衍生化物的峰高、峰面積明顯降低，0.15 g/kg、0.45 g/kg劑量

10、組沒有明顯的變化(P＞0.05)，色譜峰的峰高、峰面積沒有明顯變化。雄黃染毒肺臟中活性硫水平0.45 g/kg組顯著升高(P＜0.05)，色譜圖中活性硫的MBB衍生化物的峰高、峰面積明顯升高，0.15 g/kg、1.35 g/kg組沒有明顯的變化(P＞0.05)，色譜峰的峰高、峰面積沒有明顯變化。心臟、脾臟及睪丸各雄黃染毒劑量組與對照組比較沒有明顯的變化(P＞0.05)，色譜峰的峰高、峰面積沒有明顯變化。結(jié)果表明雄黃可使血漿、腦、肝臟、

11、腎臟中活性硫水平明顯降低，肺臟中活性硫水平呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，對心臟、脾臟及睪丸中活性硫水平的影響不明顯。與對照組比較，甘草次酸組對小鼠血漿、腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及睪丸中活性硫水平的影響不明顯(P＞0.05)，色譜峰的峰高、峰面積沒有明顯變化。與雄黃染毒1.35 g/kg組相比較，甘草次酸干預(yù)組血漿的甘草次酸(16mg/kg)+雄黃(1.35 g/kg)組和甘草次酸(48 mg/kg)+雄黃(1.35 g/kg)組、腦

12、的甘草次酸(48mg/kg)+雄黃(1.35g/kg)組、肝臟的甘草次酸(48 mg/kg)+雄黃(1.35g/kg)組、腎臟的甘草次酸(48mg/kg)+雄黃(1.35 g/kg)組中活性硫水平明顯升高(P＜0.05)，色譜圖中活性硫的MBB衍生化物的峰高、峰面積明顯升高，其他組別沒有明顯的變化(P＞0.05)，色譜峰的峰高、峰面積沒有明顯變化。甘草次酸干預(yù)組各臟器中活性硫水平與對照組比較沒有明顯的變化(P＞0.05)，色譜峰的峰高、