硫糖肽的制備及其抗胃潰瘍的活性研究.pdf

1、胃潰瘍(gastriculcer，GU)指胃內(nèi)受胃液、胃酸和胃蛋白酶調(diào)節(jié)范圍的黏膜層、黏膜下層，甚至肌層和漿膜在多種因素的影響下發(fā)生的局限性組織缺損性疾病。其主要特點(diǎn)是容易復(fù)發(fā)，難于防止，因此提高潰瘍愈合質(zhì)量是治愈GU的關(guān)鍵因素。近年來研究表明潰瘍愈合質(zhì)量與修復(fù)受損黏膜密切相關(guān)，GU的愈合不僅要求黏膜表面的修復(fù)，下層的修復(fù)更為重要。通過對GU發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)抗炎和胃腸粘膜保護(hù)已經(jīng)成為GU治療的重要原則。
　　 黏多糖類物質(zhì)作為

2、構(gòu)成生命的基本物質(zhì)之一，參與許多重要的生理活動，其獨(dú)特的生物活性已成為生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)的具有生物活性的糖類已有上百種，對其結(jié)構(gòu)和功能的研究越來越深入，其中黏多糖類廣泛的抗炎活性引起人們的重視，且其作用機(jī)制多樣，同時發(fā)現(xiàn)經(jīng)過修飾后的糖類衍生物，由于其結(jié)構(gòu)的改變，生物活性也有顯著的增強(qiáng)。
　　 鑒于此，本實驗采用硫糖肽為研究對象，以豬十二指腸為原料提取糖肽，經(jīng)磺化修飾制備硫糖肽；并進(jìn)行處方優(yōu)化，在此基礎(chǔ)以豬十二

3、指腸類肝素為原料開辟制備硫糖肽的新途徑，制備硫糖肽類物質(zhì)；用大鼠胃潰瘍模型進(jìn)行抗胃潰瘍活性篩選，并對活性硫糖肽進(jìn)行分離純化，測定其分子量；為比較硫糖肽的藥理活性與其糖鏈部分的關(guān)系，采用酶解法將硫糖肽中的糖鏈釋放出；為研究硫糖肽的抗炎和抗?jié)兓钚?，本實驗在體外檢測了硫糖肽及其糖鏈對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-a和IL-4的作用，并在體內(nèi)考察硫糖肽對實驗性胃潰瘍大鼠的治療作用。本研究取得的結(jié)論有以下幾個方面：
　　 1糖肽的提取制備

4、及磺化工藝優(yōu)化豬十二指腸經(jīng)過脫脂、酶解和離子交換純化得到粗品糖肽，運(yùn)用強(qiáng)陰離子交換樹脂交換吸附雜質(zhì)，精制糖肽，收率為0.96％～1.17％，比文獻(xiàn)報道的0.5％～0.66％提高將近一倍。醋酸纖維素薄膜電泳鑒定產(chǎn)物較為純凈，利用苯酚-硫酸法測定其總糖含量為(22.47±1.41)％，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定糖肽蛋白含量為(14.15±1.06)％。糖肽采用三種磺化方法進(jìn)行化學(xué)修飾，產(chǎn)物表示為SG。通過三種方法的優(yōu)劣比較，確定采用氯磺酸

5、-甲酰胺法，進(jìn)而設(shè)計反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、氧化除氨pH三個因素考察在此條件下四個水平的工藝路線，設(shè)計正交試驗進(jìn)行處方優(yōu)化，以產(chǎn)物硫酸基團(tuán)和總糖含量作為檢測指標(biāo)，篩選出磺化最佳工藝為氯磺酸-甲酰胺法，反應(yīng)溫度23℃，反應(yīng)時間8h，氧化除氨pH9.5。采用最佳工藝磺化三個批次的類肝素產(chǎn)品，產(chǎn)物以HPS-1，HPS-2，HPS-3表示，探索制備硫糖肽的新途徑。各批次磺化產(chǎn)物產(chǎn)物采用超濾脫鹽，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測純度。
　　 2具有抗胃

6、潰瘍作用的活性硫糖肽的篩選及分離純化無水乙醇灌胃處理大鼠，建立大鼠胃潰瘍模型，以潰瘍指數(shù)、病理切片為檢測指標(biāo)，從四種磺化產(chǎn)品中篩選出具有抗胃潰瘍活性的硫糖肽SG和HPS-1。結(jié)果表明硫酸基團(tuán)和總糖含量較高者，抗胃潰瘍活性為強(qiáng)。QFF強(qiáng)陰離子交換層析色譜對活性硫糖肽進(jìn)行分離純化，得到不同離子強(qiáng)度的硫糖肽組分SG-1、SG-2、SG-3、SG-4、SG-5以及HPS-1-1、HPS-1-2。
　　 3硫糖肽中糖鏈的釋放及硫糖肽分子量

7、的測定采用酶解法釋放出活性硫糖肽中的糖鏈，產(chǎn)物分別為S-1和H-1。紫外掃描光譜技術(shù)(UV)考察硫糖肽及其糖鏈的特征吸收情況，結(jié)果顯示硫糖肽中含有多糖和氨基酸組分，而糖鏈中僅有多糖。運(yùn)用多角度激光散射技術(shù)確定活性硫糖肽各組分的重均分子量Mw，其中SG和HPS-1分子量分別為99.54kDa和33.97kDa。
　　 4硫糖肽各組分及糖鏈部分對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞生長因子的影響利用貼壁純化法培養(yǎng)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，采用臺盼藍(lán)拒染實驗和M

8、TT實驗測定硫糖肽各組分及其糖鏈部分對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力的作用，酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定大鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中TNF-a和IL-4的含量。結(jié)果顯示硫糖肽糖鏈及其組分對巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞抑制作用，隨著濃度升高，抑制作用更加明顯，抑制作用最明顯的為SG-4，其在10μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL不同濃度下對巨噬細(xì)胞的抑制率分別為（1.69±0.32）％、（4.31±0.43）％、(6.16±0.

9、37)％、（8.71±0.82）％。通過硫糖肽對TNF-a和IL-4表達(dá)的抑制作用，篩選出療效較好的組分：SG-3、SG-4，其中RatTNF-a在SG-3濃度分別為250μg/mL和500μg/mL中的含量307.40±25.71pg/mL和230.59±24.42pg/mL，SG-4濃度分別為250μg/mL和500μg/mL中RatTNF-a的含量為243.55±4.18pg/mL和207.18±35.68pg/mL，明顯低于模型

10、組508.09±30.53pg/mL，RatIL-4在SG-3濃度分別為250μg/mL和500μg/mL中的含量54.981±.03pg/mL和46.43±0.55pg/mL，SG-4濃度分別為250μg/mL和500μg/mL中RatIL-4的含量為49.981±.68pg/mL和43.40±1.20pg/mL，明顯低于模型組73.43±4.54pg/mL。初步證實硫糖肽各組分及其糖鏈部分對巨噬細(xì)胞分泌前炎癥細(xì)胞因子有抑制作用。

11、r>　　 5SG-3和SG-4對實驗性胃潰瘍大鼠的治療作用采用改良Okabe法建立大鼠胃潰瘍模型，考察SG-3和SG-4對實驗性胃潰瘍大鼠的治療作用。潰瘍組織HE染色顯示不同濃度的SG-3和SG-4均能治療大鼠胃潰瘍?？疾炝肆蛱请膶aspase3、EGFR、NO、NOS和EGF、ET-1的表達(dá)情況。治療16d后，高劑量的SG-4對上述指標(biāo)的的表達(dá)作用分別是：caspase3抑制率為(81.22±1.62)％，EGFR增長2.25±0

12、.11倍，NO下降至(34.55±2.38)μmol/L，cNiOS增加至(8.43±0.84)U/mL，iNOS下降至(6.81±1.99)U/mL，EGF增加至(35.49±2.67)pg/mL，ET-1下降至(6.31±0.32)pg/mL，與模型組相比具有顯著差異，并與劑量成正相關(guān)，隨治療時間和劑量增加而表現(xiàn)明顯的改善作用。通過四個給藥組對胃潰瘍大鼠Caspase3、EGFR、NO、NOS和EGF、ET-1表達(dá)的顯著改善效果，證