力、化學(xué)刺激對肝癌干細胞遷移、分化行為的影響及其相關(guān)分子機理.pdf

1、癌癥是嚴重危害人類健康和生命的惡性疾病。在世界范圍內(nèi)，腫瘤死亡率前三位依次是肺癌、胃癌和肝癌。近年來肝癌的發(fā)病率不斷上升，對肝癌的治療和預(yù)防以及相關(guān)機理探索一直是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點。目前對于肝癌的治療方案主要有外科手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)藥物治療以及肝移植等，但這些方法還不能從根本上解決其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問題，肝癌的預(yù)防和治療仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。
　　癌干細胞（CSCs）是惡性腫瘤組織中具有很強增殖能力、表現(xiàn)干細胞特性的細胞亞群，具備高

2、度自我更新和分化潛能，不僅是惡性腫瘤的啟動細胞，而且是形成不同分化程度癌細胞和癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良的根源，在癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中起決定作用，其靶向干預(yù)是癌癥治療的全新策略。
　　癌癥的發(fā)生發(fā)展是一個多因素調(diào)控的復(fù)雜過程，受到多種力學(xué)、化學(xué)因素的影響。在CSCs靶向干預(yù)的抗癌策略中，如何阻止CSCs轉(zhuǎn)移或誘導(dǎo)CSCs分化都是CSCs靶向干預(yù)的重要手段，但目前人們對于力學(xué)、化學(xué)因素調(diào)控CSCs侵襲轉(zhuǎn)移和分化等生物學(xué)行為的特征及相關(guān)機理

3、還缺乏系統(tǒng)認識。為此，本課題以肝癌干細胞（LCSCs）為研究對象，首先考察了LCSCs的生物力學(xué)特質(zhì)，然后研究了力學(xué)因素（剪切應(yīng)力,SS）、化學(xué)因素（鹽霉素,Sal）對LCSCs轉(zhuǎn)移、分化行為的影響及相關(guān)分子機制。本研究工作的主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　?、?LCSCs的富集、鑒定及生物力學(xué)特質(zhì)分析
　　采用無血清干細胞專用培養(yǎng)液通過體外腫瘤球培養(yǎng)方法從高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞MHCC97H中篩選、富集LCSCs，對其癌干細胞特征及生物

4、力學(xué)特質(zhì)進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選出的細胞相比母代MHCC97H細胞高表達癌干細胞標志物CD133、CD90、Oct3/4，具有更強的克隆形成能力、抗癌藥物耐藥性和裸鼠體內(nèi)成瘤能力，表明篩選出的細胞具有癌干細胞表型，符合癌干細胞特征。
　　Transwell遷移實驗發(fā)現(xiàn)，LCSCs比MHCC97H細胞具有更強的遷移能力。原子力顯微鏡（AFM）檢測顯示，LCSCs的楊氏模量顯著小于MHCC97H細胞。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，LCS

5、Cs的細胞骨架F-actin呈點狀結(jié)構(gòu)，而MHCC97H細胞呈明顯的絲狀結(jié)構(gòu)。Western blot實驗進一步發(fā)現(xiàn)，與MHCC97H細胞相比，LCSCs中細胞骨架F-actin的表達顯著減少。這些結(jié)果表明， LCSCs的生物力學(xué)特質(zhì)與其高轉(zhuǎn)移潛能有很密切的關(guān)系。
　?、诩羟袘?yīng)力通過FAK-ERK1/2-β-catenin信號通路促進LCSCs的遷移
　　癌癥是嚴重危害人類健康和生命的惡性疾病。在世界范圍內(nèi)，腫瘤死亡率前三位

6、依次是肺癌、胃癌和肝癌。近年來肝癌的發(fā)病率不斷上升，對肝癌的治療和預(yù)防以及相關(guān)機理探索一直是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點。目前對于肝癌的治療方案主要有外科手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)藥物治療以及肝移植等，但這些方法還不能從根本上解決其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問題，肝癌的預(yù)防和治療仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。
　　癌干細胞（CSCs）是惡性腫瘤組織中具有很強增殖能力、表現(xiàn)干細胞特性的細胞亞群，具備高度自我更新和分化潛能，不僅是惡性腫瘤的啟動細胞，而且是形成不同分化程度

7、癌細胞和癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良的根源，在癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中起決定作用，其靶向干預(yù)是癌癥治療的全新策略。癌癥的發(fā)生發(fā)展是一個多因素調(diào)控的復(fù)雜過程，受到多種力學(xué)、化學(xué)因素的影響。在CSCs靶向干預(yù)的抗癌策略中，如何阻止CSCs轉(zhuǎn)移或誘導(dǎo)CSCs分化都是CSCs靶向干預(yù)的重要手段，但目前人們對于力學(xué)、化學(xué)因素調(diào)控CSCs侵襲轉(zhuǎn)移和分化等生物學(xué)行為的特征及相關(guān)機理還缺乏系統(tǒng)認識。為此，本課題以肝癌干細胞（LCSCs）為研究對象，首先考察了LCS

8、Cs的生物力學(xué)特質(zhì)，然后研究了力學(xué)因素（剪切應(yīng)力,SS）、化學(xué)因素（鹽霉素, Sal）對LCSCs轉(zhuǎn)移、分化行為的影響及相關(guān)分子機制。本研究工作的主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　① LCSCs的富集、鑒定及生物力學(xué)特質(zhì)分析
　　采用無血清干細胞專用培養(yǎng)液通過體外腫瘤球培養(yǎng)方法從高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞MHCC97H中篩選、富集LCSCs，對其癌干細胞特征及生物力學(xué)特質(zhì)進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選出的細胞相比母代MHCC97H細胞高表達癌干細

9、胞標志物CD133、CD90、Oct3/4，具有更強的克隆形成能力、抗癌藥物耐藥性和裸鼠體內(nèi)成瘤能力，表明篩選出的細胞具有癌干細胞表型，符合癌干細胞特征。
　　Transwell遷移實驗發(fā)現(xiàn)，LCSCs比MHCC97H細胞具有更強的遷移能力。原子力顯微鏡（AFM）檢測顯示，LCSCs的楊氏模量顯著小于MHCC97H細胞。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，LCSCs的細胞骨架F-actin呈點狀結(jié)構(gòu)，而MHCC97H細胞呈明顯的絲狀結(jié)構(gòu)。W

10、estern blot實驗進一步發(fā)現(xiàn)，與MHCC97H細胞相比，LCSCs中細胞骨架F-actin的表達顯著減少。這些結(jié)果表明， LCSCs的生物力學(xué)特質(zhì)與其高轉(zhuǎn)移潛能有很密切的關(guān)系。
　?、诩羟袘?yīng)力通過FAK-ERK1/2-β-catenin信號通路促進LCSCs的遷移
　　采用平行平板流動腔系統(tǒng)建立模擬體內(nèi)LCSCs血道轉(zhuǎn)移模型，考察了血流剪切應(yīng)力作用下LCSCs遷移行為的變化及相關(guān)分子機制。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 dyne/

11、cm2剪切應(yīng)力加載6 h后明顯促進LCSCs的遷移能力，粘著斑激酶（FAK）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）磷酸化水平明顯增加，β-鏈蛋白（β-catenin）的表達也明顯增加，抑制FAK或ERK1/2激活或沉默β-catenin后，剪切應(yīng)力促進的LCSCs遷移受到明顯抑制。
　　免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)，剪切應(yīng)力加載后LCSCs F-actin的表達下降，抑制FAK、ERK1/2后，也抑制了剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的F-actin下調(diào)

12、。進一步利用AFM檢測了細胞楊氏模量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)剪切應(yīng)力加載顯著降低了LCSCs的楊氏模量；抑制FAK、ERK1/2或β-catenin后，下降的LCSCs楊氏模量得到了恢復(fù)。此外，F(xiàn)AK抑制劑可阻斷剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化以及β-catenin蛋白的表達，ERK1/2抑制劑可阻斷β-catenin蛋白的表達。上述結(jié)果提示，剪切應(yīng)力可能通過FAK-ERK1/2-β-catenin信號途徑使LCSCs的細胞骨架F-actin重

13、排，降低細胞硬度，從而增加LCSCs的遷移能力。
　　③剪切應(yīng)力通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控LCSCs的分化行為
　　對LCSCs施加2 dyne/cm2剪切應(yīng)力加載2天后，通過流式細胞術(shù)檢測LCSCs癌干細胞標志物CD133、CD90、Oct3/4的表達。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，剪切應(yīng)力作用后CD133、CD90、Oct3/4的表達顯著下降。腫瘤球體形成實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)2 dyne/cm2剪切應(yīng)力加載2天后， LCSCs的

14、球體形成能力顯著下降；LiCl預(yù)處理激活Wnt/β-catenin信號通路，剪切應(yīng)力抑制的球體形成能力得到了恢復(fù)。藥物敏感實驗顯示，2 dyne/cm2剪切應(yīng)力加載2天后，LCSCs對順鉑（Cisplatin）和5-氟尿嘧啶（5-FU）的敏感度增高，生存率明顯下降。AFM分析發(fā)現(xiàn)剪切應(yīng)力加載后LCSCs楊氏模量顯著增加；利用LiCl激活β-catenin，抑制了剪切應(yīng)力增加的細胞楊氏模量。
　　Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，2

15、 dyne/cm2剪切應(yīng)力作用LCSCs2天后，β-catenin的表達明顯下降，利用LiCl激活β-catenin，剪切應(yīng)力促進的LCSCs分化受到明顯抑制，CD133、CD90、Oct3/4的表達顯著恢復(fù)。裸鼠體內(nèi)致瘤實驗表明，LCSCs經(jīng)剪切應(yīng)力作用2天后，其致瘤能力明顯下降，激活β-catenin，致瘤能力得到恢復(fù)。上述結(jié)果提示，2 dyne/cm2剪切應(yīng)力作用LCSCs2天后可通過Wnt/β-catenin信號通路使其發(fā)生分化

16、。
　　④鹽霉素通過FAK-ERK1/2信號通路調(diào)控LCSCs的運動能力
　　Transwell法檢測發(fā)現(xiàn)，鹽霉素明顯抑制LCSCs的遷移和侵襲能力，并在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性。Western blot檢測表明，鹽霉素作用LCSCs后，F(xiàn)AK和ERK1/2磷酸化水平明顯降低。此外，F(xiàn)AK、ERK1/2抑制劑也可抑制LCSCs的遷移和侵襲能力。因此，鹽霉素可能通過FAK-ERK1/2信號通路抑制LCSCs遷移和侵襲。明膠

17、酶譜實驗表明，鹽霉素抑制 LCSCs基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）分泌。此外，免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)鹽霉素作用后LCSCs F-actin的表達上升，F(xiàn)AK、ERK1/2抑制劑也可促進F-actin上調(diào)。進一步利用AFM檢測發(fā)現(xiàn)鹽霉素處理顯著增加了 LCSCs的楊氏模量，F(xiàn)AK、ERK1/2抑制劑作用后也升高了LCSCs的楊氏模量。上述結(jié)果提示，鹽霉素可能通過FAK-ERK1/2信號通路促進F-actin表

18、達，增加細胞硬度，減少MMP-2、MMP-9的分泌，從而抑制了LCSCs的運動能力。
　　⑤鹽霉素通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控LCSCs的分化行為
　　利用鹽霉素對LCSCs處理2天后，通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)LCSCs癌干細胞標志物CD133、CD90、Oct3/4的表達顯著下降。腫瘤球體形成實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鹽霉素處理后LCSCs的球體形成能力顯著下降，利用LiCl激活β-catenin，腫瘤球體形成能力得到了恢復(fù)

19、。藥物敏感實驗發(fā)現(xiàn)，鹽霉素作用2天后的 LCSCs，對于Cisplatin和5-FU的敏感度增高，生存率明顯下降。此外，進一步利用AFM檢測發(fā)現(xiàn)鹽霉素可以顯著增加LCSCs的楊氏模量。利用LiCl激活β-catenin后，細胞的楊氏模量得到明顯恢復(fù)。
　　Western blot檢測表明，鹽霉素作用LCSCs2天后，β-catenin的表達明顯下降，利用LiCl激活β-catenin，剪切應(yīng)力促進的LCSCs分化受到明顯抑制，LC

20、SCs的癌干細胞標志物 CD133、CD90、Oct3/4的表達顯著恢復(fù)。裸鼠體內(nèi)致瘤實驗表明， LCSCs經(jīng)鹽霉素作用后，瘤體大小明顯下降，激活β-catenin，致瘤能力得到恢復(fù)。上述結(jié)果提示，鹽霉素作用LCSCs2天后可通過Wnt/β-catenin信號通路使其發(fā)生了分化。
　　綜合上述結(jié)果，剪切應(yīng)力在調(diào)控LCSCs轉(zhuǎn)移、分化行為過程中起到了至關(guān)重要的作用，此外發(fā)現(xiàn)鹽霉素可以抑制LCSCs轉(zhuǎn)移、促使其分化。本研究結(jié)果為深入認