炎癥相關(guān)刺激對乳腺癌細胞MCF-7遷移能力的影響及其分子機制的初步研究.pdf

1、惡性腫瘤是人類死亡的第二大主要因素，而且有逐漸上升的趨勢，在有些發(fā)達國家，惡性腫瘤甚至以成為危害人類生命安全的頭號殺手。 而其中，乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于女性惡性腫瘤之首。腫瘤生長的微環(huán)境是促進腫瘤進展和活化休眠的癌細胞的潛在致癌因素。許多實體腫瘤中都可以發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤，如腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）和巨噬細胞。這些炎癥細胞在腫瘤的發(fā)展中具有重要的作用：細胞轉(zhuǎn)化、血管生成、轉(zhuǎn)移。的確，在人乳腺癌和結(jié)直腸癌中

2、的巨噬細胞浸潤與腫瘤的血管生長之間有著密切聯(lián)系，然而，腫瘤細胞原位產(chǎn)生的細胞因子發(fā)揮功能的重要性還不清楚。許多腫瘤的另一種特性是腫瘤細胞的低氧狀態(tài)和活性氧產(chǎn)物的生成。 前人的研究表明，TNF-α，活化的NFκB 和ROS 均可以在某些細胞引起EMT，但該效應(yīng)在乳腺癌細胞尚未見報道，而且TNF-α和ROS導(dǎo)致EMT 的機制也不清楚。而TNF-α可以活化NFκB 以及產(chǎn)生ROS，因此我們認為很有必要研究活化的NFκB 和ROS 如何

3、導(dǎo)致EMT 以及各自在TNF-α誘導(dǎo)EMT 中的作用。 在發(fā)生EMT 的過程中，特定區(qū)域的上皮細胞基因表達發(fā)生徹底改變，其中E－鈣粘蛋白（E-cadherin）的下調(diào)似乎是關(guān)鍵事件。發(fā)生EMT 的細胞失去細胞極性和細胞間連接，細胞外基質(zhì)成分發(fā)生降解，細胞變得具有遷移性，可以從上皮上游離下來并遷移到不同的部位。 EMT 可由Snail 從不同途徑得到啟動。Snail 在這個過程中發(fā)揮核心作用，協(xié)調(diào)不同的信號途徑。

4、 因此，本實驗首先觀察了TNF-α對乳腺癌細胞系MCF-7 遷移能力的影響，在此基礎(chǔ)上觀察了TNF-α和ROS 對重要的轉(zhuǎn)錄因子Snail以及其下游分子E-cadherin 的表達的影響，探討了其中的可能機制。 盡管MCF-7 細胞的侵襲能力較低，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過TNFα處理后其侵襲能力增強，遷移的細胞數(shù)目達到對照組的兩倍。與此一致，細胞表達的E-cadherin 水平下降，而Vimentin 水平升高。在此過程中Snail的

5、表達增加。 此外，我們的實驗發(fā)現(xiàn)NFκB的抑制劑阿司匹林可以阻止TNFα誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，這表明在TNFα引發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，NFκB扮演著重要作用。NFκB的抑制劑阿司匹林和mIκBα可以抑制Snail的表達增加以及Snail啟動子的活性。相反，我們的實驗發(fā)現(xiàn)活性氧在TNFα促進細胞轉(zhuǎn)移時扮演著次要作用，因為單純清除TNFα產(chǎn)生的ROS并不明顯抑制EMT的發(fā)生。但是，我們的實驗發(fā)現(xiàn)H2O2自身可以促進EMT，其作用通路與T

6、NFα誘導(dǎo)的EMT不同，其中NFκB僅發(fā)揮了次要的作用。 簡言之，我們的實驗涉及了TNFα在刺激細胞發(fā)生EMT時所起的重要作用，其中NFκB的作用主要是通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)Snail和E-鈣粘蛋白的表達，而在活性氧引起的EMT中，NFκB的作用不十分重要，這為腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)防過程中在不同的情況作用之下選擇不同的藥物提供了依據(jù)。事實也是如此，實驗中我們發(fā)現(xiàn)Aspirin和NAC可以明顯降低TNFα和H2O2處理后遷移的細胞數(shù)，即可分別有效的

7、抑制TNFα和H2O2誘發(fā)的EMT。 基于前面的實驗結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn)ROS 可以誘導(dǎo)Snail 的表達，促進EMT 的發(fā)生。而ROS 的形成貫穿于很多生理病理過程。如表皮生長因子（EGF），成纖維細胞生長因子（FGF），轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)，肝細胞生長因子（HGF），這些生長信號刺激下均有ROS 的產(chǎn)生。這些信號分子已經(jīng)證實可以在不同的細胞背景下誘導(dǎo)Snail 基因。所有這些提示ROS 參與了多種信號條件下的EMT 的發(fā)

8、生。但是，前面的實驗提示ROS 下游分子NFκB 在過程中并不扮演決定性作用。這使我們聯(lián)想到轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。 除了轉(zhuǎn)錄水平之外，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，如mRNA轉(zhuǎn)運和翻譯，在基因的表達中也有重要的作用。盡管決定mRNA轉(zhuǎn)運的機制仍然不清楚，但大家普遍認為可能涉及到RNA結(jié)合蛋白識別特殊的RNA序列。近來大家較為關(guān)注一種調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性，由富含AU元件（AREs）介導(dǎo)的特殊途徑，這一般發(fā)生于生存期短的mRNAs的3 端非翻譯區(qū)。HuR

9、蛋白可以結(jié)合攜帶AREs的靶mRNA通過其RNA可識別區(qū)，從而調(diào)節(jié)許多靶mRNA的表達，包括編碼c-fos, 血管內(nèi)皮生長因子，腫瘤壞死因子α,β-連環(huán)蛋白（?-catenin）,c-myc, 還氧化酶2（cyclooxygenase 2），肌細胞生成素（myogenin），MyoD，多種細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，粒-巨噬細胞集落刺激因子，多種白細胞介素，p21, p27, p53 和熱休克蛋白70。 有趣的是，H2O2能夠增強HuR

10、的細胞漿定位，進而增強HuR的功能。 對Snail的mRNA的結(jié)構(gòu)進行分析，我們發(fā)現(xiàn)Snail分子含有多個HuR結(jié)合元件ARE，這促使我們聯(lián)想到H2O2可能通過增強HuR的細胞漿定位。 首先，我們用合成的HuR的siRNA和對照siRNA對MCF-7細胞進行轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后36小時用Western blotting檢測轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)70％的內(nèi)源性HuR被敲除。合成的HuR的siRNA和對照siRNA轉(zhuǎn)然后36小時的細胞加入

11、50μM H2O2 ，12小時后提取RNA。在si-HuR組可見Snail mRNA的減少，表明HuR在這個過程中發(fā)揮了作用，蛋白水平也發(fā)生同樣的變化。接著我們觀察了在HuR敲除細胞和對照組細胞中Snail的半衰期。 在加入H2O2 12小時后加入放線菌素D阻斷轉(zhuǎn)錄，在si-HuR可出現(xiàn)Snail半衰期的縮短，這說明了HuR可以增加Snail的穩(wěn)定性。 由于HuR一般是通過靶基因的位于3`端非翻譯區(qū)的ARE元件實現(xiàn)其

12、功能的，我們考慮是否HuR參與了通過假設(shè)的AREs調(diào)節(jié)Snail的3`端非翻譯區(qū)。因此我們將包括AREs的3’UTR和不含AREs的片斷分別克隆至pGL3-control載體,命名為pGL3-control-Snail 和pGL3-control-△Snail并轉(zhuǎn)染至si-HuR MCF-7細胞和對照細胞。在沒有經(jīng)過H2O2處理和HuR敲除的MCF-7細胞，相比于pGL3-control-△Snail，pGL3-control-Snai

13、l的活性較差，這說明了AREs作為一個元件發(fā)揮了穩(wěn)定性。另外，在HuR沒有敲除的MCF-7細胞，只有含有AREs的結(jié)構(gòu)對H2O2處理有反應(yīng)（H2O2處理后大約有2倍的變化），而在si-HuR MCF-7細胞中，包含AREs的結(jié)構(gòu)也很少對H2O2發(fā)生反應(yīng)。這些結(jié)果都顯示H2O2通過ARE 和HuR的相互作用增加Snail 的表達。 HuR主要位于細胞核中，在應(yīng)激條件下可以作為mRNA穩(wěn)定劑或翻譯調(diào)節(jié)因子進入細胞漿中。為了評估H2

14、O2處理后引起相應(yīng)的HuR分布的變化，我們用經(jīng)過H2O2處理和未經(jīng)過處理的細胞用western blot方法研究亞細胞分布。結(jié)果顯示HuR主要位于細胞核中，經(jīng)過H2O2處理后6 小時，HuR在細胞質(zhì)中含量增多，但細胞內(nèi)總的HuR含量沒有明顯變化。這些結(jié)果顯示，H2O2增加Snail的表達至少部分的通過使HuR富集于細胞漿中而參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控實現(xiàn)的。但是，我們的實驗并不否認轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要性。事實上，Snail極少表達于沒有H2O2作用的MC

15、F-7 細胞中，因此，我們認為經(jīng)過H2O2作用的MCF-7 細胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在下調(diào)Snail 中都具有重要作用。 最后，我們觀察了敲除HuR對H2O2誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)移的影響。我們觀察進行和沒有進行HuR敲除的MCF-7 細胞在H2O2作用下mRNA水平和蛋白水平上皮細胞鈣粘蛋白的表達。在沒有進行HuR敲除組，H2O2處理后MCF-7 細胞上皮細胞鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)錄減少（約4 倍）。在經(jīng)過HuR敲除地MCF-7 細胞中，這種

16、抑制過程僅部分地而不是全部地被消除（經(jīng)H2O2處理后大約2 倍下調(diào)），這表明HuR在誘導(dǎo)Snail和后續(xù)的抑制上皮細胞鈣粘蛋白過程中僅是部分地發(fā)揮作用。而且，單獨的HuR敲除似乎對于上皮細胞鈣粘蛋白的表達沒有作用。和mRNA情況相同，上皮細胞鈣粘蛋白的蛋白水平表現(xiàn)出了同樣的變化。我們還發(fā)現(xiàn)H2O2處理后si-HuR細胞的轉(zhuǎn)移能力明顯下降。因此，除了抗細胞凋亡能力之外，HuR可能還在細胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。 總之，我們的研究