Sa-hTNFα-hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP細(xì)胞疫苗對(duì)PC3異種移植瘤治療效果的研究.pdf

1、背景:
　　前列腺癌發(fā)病率不斷上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)2015年檢出率在所有腫瘤中排第二，死亡率排第一，成為危害男性健康的惡性腫瘤。腫瘤常規(guī)三大療法:手術(shù)、化療、放療。但常規(guī)療法特異性不足，常常對(duì)正常器官和組織有損傷，損害了患者的生存質(zhì)量。免疫治療可以誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)腫瘤的特異性反應(yīng)，甚至能清除殘余的腫瘤病灶，誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫記憶。
　　腫瘤細(xì)胞疫苗屬于免疫療法，完整的、滅活的腫瘤細(xì)胞包含腫瘤所有抗原，腫瘤特異性抗原刺激

2、機(jī)體免疫系統(tǒng)，并產(chǎn)生針對(duì)此種腫瘤的特異性免疫反應(yīng)。在腫瘤免疫中，T淋巴細(xì)胞應(yīng)答具有至關(guān)重要的作用。但單獨(dú)的腫瘤細(xì)胞往往對(duì)機(jī)體的刺激不足，難以介導(dǎo)抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)作用，在腫瘤細(xì)胞疫苗中往往會(huì)添加免疫佐劑，增強(qiáng)疫苗的免疫原性。GM-CSF和TNFα都是良好的免疫佐劑，能夠很好地刺激粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、尤其是樹突狀細(xì)胞的增殖、分化，增強(qiáng)機(jī)體免疫強(qiáng)度，而且二者有很好的免疫協(xié)同作用。
　　針對(duì)前列腺癌在發(fā)展和和治療中易

3、由雄激素依賴階段演變?yōu)樾奂に胤且蕾囆偷奶匦?，已進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)的GVAX(R)前列腺癌疫苗利用LNCaP和PC-3兩個(gè)細(xì)胞系作為抗原，LNCaP分泌總前列腺特異性抗原(tPSA)，具有前列腺癌腫瘤細(xì)胞早期分化的特征，用于抗早期雄激素依賴性的前列腺癌;PC-3作為雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞，已被廣泛用于雄激素抵抗型的前列腺癌的研究。但該疫苗的制備需要兩種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的培養(yǎng)制備，工序復(fù)雜、成本高、耗時(shí)較長，若利用我們的細(xì)胞膜表面錨定修飾技術(shù)

4、，而且能僅用一種細(xì)胞作為疫苗制備的抗原可以同時(shí)治療激素依賴和非依賴的前列腺癌將會(huì)很大程度的改善這些問題。
　　我們前期工作中，驗(yàn)證了SA-hTNFa/hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP細(xì)胞疫苗對(duì)雄激素依賴的LNCaP前列腺癌療效顯著。此次，用PC-3細(xì)胞在hu-PBL-NOD/SCID小鼠皮下成瘤建造雄激素非依賴型前列腺癌模型，檢驗(yàn)SA-hTNFa/hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP疫苗對(duì)雄激素非依賴前列腺癌的治療效果，本

5、實(shí)驗(yàn)將SA-hTNFa/hGM-CSF雙重錨定修飾的PC-3細(xì)胞疫苗組作為參照實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行研究，研究顯示SA-hTNFa/hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP疫苗與SA-hTNFa/hGM-CSF雙重錨定修飾的PC-3細(xì)胞疫苗對(duì)雄激素非依賴的PC-3前列腺癌治療效果無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　綜上說明SA-hTNFa/hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP疫苗既對(duì)雄激素依賴前列腺癌有治療效果，又對(duì)雄激素非依賴前列腺癌有治療效果。可得在

6、整個(gè)前列腺癌治療過程中可以用單一的LNCaP細(xì)胞系作為抗原制作腫瘤疫苗，與GVAX(R)前列腺癌疫苗需要制備兩種細(xì)胞系相比，大大簡化了腫瘤疫苗的制作流程，節(jié)約了時(shí)間和成本，并且疫苗批次間更加穩(wěn)定。
　　目的:
　　1.SA-hGM-CSF和SA-hTNFα重組蛋白進(jìn)行活性鑒定，及錨定率流式檢測。疫苗表面錨定蛋白生物活性檢測
　　2.建立具有人免疫系統(tǒng)的人外周血淋巴細(xì)胞-重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠嵌合體(hu-PBL-NOD/

7、SCID)模型，鑒定小鼠是否發(fā)生移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)。
　　3.建立小鼠皮下腫瘤PC-3前列腺癌模型，比較SA-hTNFα/hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP細(xì)胞疫苗和SA-hTNFα/hGM-CSF雙重錨定修飾的PC-3細(xì)胞疫苗在動(dòng)物水平的抗腫瘤效果。
　　4.監(jiān)測小鼠的體重、精神狀態(tài)，對(duì)小鼠主要臟器進(jìn)行HE染色，鑒定疫苗是否對(duì)小鼠有毒副作用。
　　方法

8、:
　　1.蛋白活性檢測:SDS-PAGE凝膠電泳鑒別SA-hTNFα蛋白SA-hGM-CSF蛋白的純化復(fù)性狀況。TNFα蛋白對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞系L929有毒副作用，入紅白血病細(xì)胞的生長增殖需依賴GM-CSF蛋白，我們通過梯度稀釋這兩種蛋白和錨定蛋白的疫苗檢測對(duì)特異性細(xì)胞系生長增殖的影響來鑒定蛋白活性。
　　2.疫苗制作:將LNCaP細(xì)胞和PC-3細(xì)胞用30％酒精室溫固定30min，1mg/ml生物素化試劑37℃孵育30min

9、進(jìn)行生物素化，將重組蛋白SA-hTNFα蛋白、SA-hGM-CSF蛋白室溫孵育1h制成前列腺癌治療性疫苗。利用流式細(xì)胞技術(shù)來檢測兩種重組蛋白的錨定效率，確定是否達(dá)到要求。
　　3.造模及疫苗效果檢測:敲除NK細(xì)胞后的NOD/SCID小鼠腹腔注射4×107 PBMCs/只，建立嵌合體小鼠，4周后檢測小鼠血液中hCD+4T細(xì)胞和hCD+8 T細(xì)胞。肋脅部皮下注射5×105PC-3前列腺癌細(xì)胞造模，此為觀察期第0天。在第0、7、14天分

10、別注射SA-hTNFα/ hGM-CSF雙重錨定的LNCaP前列腺癌治療性疫苗、SA-hTNFα/ hGM-CSF雙重錨定修飾的PC-3前列腺癌治療性疫苗、PBS。觀察60天，每隔一天測腫瘤大小，比較這兩種前列腺癌治療性疫苗的抗腫瘤效果。60天觀察期內(nèi)，記錄每組小鼠的生存曲線。觀察期結(jié)束后，對(duì)小鼠腫瘤做免疫組化hCD+4 T細(xì)胞和hCD+8 T細(xì)胞染色，查看免疫浸潤情況。對(duì)小鼠腫瘤進(jìn)行Ki67染色，比較每組小鼠腫瘤增殖活性。
　　

11、4.腫瘤特異性細(xì)胞毒性檢測:在皮下注射PC-3細(xì)胞造模后的第21天，每組取一只小鼠，取出脾臟，分離脾細(xì)胞，先讓脾細(xì)胞與絲裂霉素處理的PC-3作用致敏，之后，絲裂霉素處理過的PC-3鋪板，加入不同細(xì)胞倍數(shù)的脾細(xì)胞作用4個(gè)小時(shí)，CCK8檢測細(xì)胞活力，計(jì)算小鼠脾細(xì)胞的腫瘤特異性細(xì)胞毒性。
　　5.檢測疫苗等是否對(duì)小鼠有副作用:觀察期期間，檢測小鼠血清中ALT、AST含量，監(jiān)測小鼠是否發(fā)生GVHD。觀察期結(jié)束后，對(duì)小鼠的重要臟器做HE染色

12、進(jìn)行組織學(xué)檢查。
　　結(jié)果:
　　1.SA-hGM-CSF和SA-hTNFα重組蛋白具有很強(qiáng)的生物活性;錨定疫苗后蛋白依舊具有生物活性;經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，錨定率達(dá)到要求。
　　2.小鼠腹腔注射hPBMC4周后血液中依舊檢測到了hCD4+T細(xì)胞和hCD8+T細(xì)胞，小鼠脾、淋巴結(jié)hCD4+和hCD8+免疫組化顯示，小鼠脾、淋巴結(jié)均有hCD4+T細(xì)胞和hCD8+T細(xì)胞浸潤，結(jié)果說明成功建立了嵌合體小鼠。檢測小鼠血清中ALT、

13、AST的含量，并沒有異常升高;小鼠精神狀態(tài)無異常;無皮疹等說明未發(fā)生移植物抗宿主病。小鼠主要臟器的HE染色觀察無異常，說明腫瘤疫苗并未造成明顯毒副作用。
　　3.SA-hTNFα/hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP前列腺癌治療性疫苗組和SA-hTNFα/hGM-CSF雙重錨定修飾的PC-3前列腺癌治療性疫苗組小鼠都有4只存活(4/4)，而PBS組只有1只小鼠存活(1/4)。疫苗組與PBS組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。小鼠

14、腫瘤中，兩疫苗組hCD4+T細(xì)胞和hCD8+T細(xì)胞浸潤程度明顯高于PBS組;免疫組化Ki67染色結(jié)果表明，PBS組腫瘤增殖活性明顯高于兩疫苗組。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)成功建立了hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型，并未發(fā)生移植物宿主病;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SA-hTNFα/hGM-CSF雙重錨定的LNCaP前列腺癌治療性疫苗也能顯著抑制PC-3腫瘤增長，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞浸潤，延長荷瘤小鼠生存期，并對(duì)小鼠無毒副作用。這說明，以LNC