GM-CSF-TNFα雙重修飾LNcaP細(xì)胞膜表面的前列腺癌治療性疫苗的制備和生物學(xué)效應(yīng)的研究.pdf

1、前列腺癌在歐美國家是男性癌死亡的主要原因之一，其發(fā)病率隨年齡增長。據(jù)統(tǒng)計，在全世界范圍內(nèi)中國人的前列腺癌發(fā)病率最低，但發(fā)現(xiàn)前列腺節(jié)段切片中病灶數(shù)與歐美地區(qū)相近，因此研究出治療前列腺癌的有效方法刻不容緩。常見治療方法中的手術(shù)切除、放射療法、冷凍療法、內(nèi)分泌療法，不僅讓患者承擔(dān)較大風(fēng)險，并且有強(qiáng)烈的副作用?；虔煼m然沒有較強(qiáng)的副作用，但確定將某一基因作為潛在診斷和治療的方向是非常關(guān)鍵的步驟，因此還需要對基因療法進(jìn)行有效的評估?；诔Ｒ娭委?/p>

2、方法的各種局限性，有必要研究出更為安全有效的前列腺癌治療方法。
　　近年來研究的腫瘤疫苗是關(guān)于惡性腫瘤治療的熱點之一，其原理是通過激活患者本身原有的免疫系統(tǒng)，利用腫瘤細(xì)胞表面或腫瘤的抗原物質(zhì)誘導(dǎo)患者機(jī)體產(chǎn)生的特異性體液免疫和特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)患者的抗腫瘤殺滅腫瘤細(xì)胞的能力，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，使之達(dá)到根治或控制腫瘤的目的。腫瘤細(xì)胞疫苗是從癌癥患者機(jī)體的腫瘤組織中提取出可以致瘤的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過射線照射或酒

3、精固定等滅活處理后使腫瘤細(xì)胞失去原有的致瘤性，但仍然保持腫瘤細(xì)胞表面抗原本來的免疫原性，然后使滅活的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫，進(jìn)而對機(jī)體進(jìn)行主動免疫。理論上腫瘤細(xì)胞可提供腫瘤抗原能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但腫瘤細(xì)胞免疫原性較低，不能有效的誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的腫瘤免疫應(yīng)答。因此，通常采用在制作的腫瘤疫苗中加入一種或幾種能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子的方法，來增強(qiáng)和提高制作的腫瘤疫苗的免疫原性，其中以粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-C

4、SF最為常用。
　　粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF是一類能夠產(chǎn)生調(diào)節(jié)造血細(xì)胞增殖和分化作用的細(xì)胞因子。在疫苗接種的部位，局部大量表達(dá)的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF能夠提高抗原提呈細(xì)胞APC數(shù)量，從而有效地捕獲、加工和提呈抗原給T細(xì)胞。而在腫瘤細(xì)胞疫苗中起到協(xié)同共刺激作用的分子，能夠提供淋巴細(xì)胞T細(xì)胞活化所需的非特性的第二信號，促進(jìn)腫瘤的免疫應(yīng)答，因此我們創(chuàng)造性地提出腫瘤壞死因子TNFα。TNFα在體內(nèi)、體外均

5、能高效率的殺死某些腫瘤細(xì)胞，或抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，是非常重要的免疫刺激因子，與GM-CSF聯(lián)合應(yīng)用有免疫協(xié)同效應(yīng)。
　　在本課題的研究中，我們已經(jīng)自主生產(chǎn)出SA-hGM-CSF和SA-hTNFα兩種蛋白，利用自主創(chuàng)新的細(xì)胞膜表面修飾技術(shù)平臺，開發(fā)研制出了GM-CSF/TNFα雙重膜表面修飾的LNcaP前列腺癌腫瘤疫苗。已成功建立hPBMC-NOD/SCID小鼠前列腺癌模型，并用GM-CSF/TNFα雙重膜表面修飾的腫瘤疫苗治療該腫

6、瘤模型。
　　目的:
　　(1)用SDS-PAGE凝膠鑒定雙功能融合蛋白SA-hGM-CSF和SA-hTNFα是否已經(jīng)制備成功;
　　(2)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定SA-hGM-CSF和SA-hTNFα在已滅活并生物素化的LNcaP腫瘤細(xì)胞膜表面的錨定率;
　　(3)分別用小鼠成纖維細(xì)胞株L929檢測SA-hTNFα的活性，用人紅白血病細(xì)胞株TF-1檢測SA-hGM-CSF的活性，及其錨定在腫瘤細(xì)胞膜表面的腫瘤疫苗的活性

7、;
　　(4)hPBMC-NOD/SCID小鼠皮下腫瘤模型的建立和鑒定;
　　(5)腫瘤疫苗對hPBMC-NOD/SCID小鼠皮下腫瘤模型治療效應(yīng)的鑒定。
　　方法:
　　(1)分別生產(chǎn)制備有活性的SA-hGM-CSF和SA-hTNFα雙功能融合蛋白;
　　(2)分別生產(chǎn)制備有活性的腫瘤疫苗:收集LNcaP細(xì)胞懸液，生物素錨定在細(xì)胞膜表面，SA-hGM-CSF/SA-hTNFα蛋白與生物素結(jié)合，繼而蛋白錨定

8、在細(xì)胞膜表面;
　　(3)建立hPBMC-NOD/SCID小鼠模型，在小鼠背部的皮下注射LNcaP腫瘤細(xì)胞（5×105個/mouse），將小鼠分為GM-CSF/TNFα雙錨定組、GM-CSF單錨定組、TNFα單錨定組、固定細(xì)胞組、PBS組。根據(jù)分組，在皮下注射腫瘤細(xì)胞后的第0、7、14天后分別給小鼠腹腔注射疫苗(2×106個/mouse);
　　(4)檢測小鼠外周血中是否有hCD4+T細(xì)胞、hCD8+T細(xì)胞浸潤，觀察小鼠的生

9、存狀況、腫瘤的增長狀況小鼠的生存率，檢測腫瘤、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)組織中hCD4+T細(xì)胞、hCD8+T細(xì)胞的浸潤情況，檢測小鼠肝臟損傷狀況，判斷小鼠模型是否出現(xiàn)移植物抗宿主病GVHD。
　　結(jié)果：
　　(1)純化、復(fù)性后的SA-hGM-CSF和SA-hTNFα雙功能融合蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳后鑒定，復(fù)性后的蛋白可以形成多聚體結(jié)構(gòu)。使用敏感細(xì)胞株分別測活鑒定，復(fù)性后的蛋白在體外有活性;
　　(2)流式細(xì)胞術(shù)鑒定

10、SA-hGM-CSF和SA-hTNFα雙功能融合蛋白可以有效地錨定在已滅活的LNcaP腫瘤細(xì)胞膜表面，且錨定率達(dá)到70％以上;
　　(3)使用敏感細(xì)胞株分別測活鑒定已制備的腫瘤疫苗的活性，證明腫瘤疫苗在體外有活性;
　　(4)人外周血單個核細(xì)胞移植入NOD/SCID小鼠腹腔4周后，流式細(xì)胞儀鑒定人外周血中的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞已轉(zhuǎn)移到小鼠外周血中。免疫組織化學(xué)分析鑒定顯示，在不同治療組的小鼠的腫瘤腫瘤、脾臟、肝臟、

11、淋巴結(jié)組織中有不同程度的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞浸潤，GM-CSF/TNFα雙錨定組浸潤T細(xì)胞數(shù)量最多，且沒有出現(xiàn)移植物抗宿主病;
　　(5)三次疫苗注射一周后，GM-CSF/TNFα雙錨定組有2只小鼠存活(2/5)，GM-CSF單錨定組有1只存活(1/5)，TNFα單錨定組有1只小鼠存活(1/5)，固定細(xì)胞組有1只小鼠存活(1/3)，PBS組全部死亡(0/3);
　　(6)GM-CSF/TNFα雙錨定組小鼠腫瘤的橫截