SA-hGM-CSF-TNFα膜表面雙重修飾前列腺癌治療性疫苗療效的研究.pdf

1、背景:
　　目前，在全球范圍內(nèi)，前列腺癌的發(fā)病率不斷上升，已成為危害老年男性健康的最常見惡性腫瘤之一。轉(zhuǎn)移、激素難治性前列腺癌在治療上仍然沒有有效方法。從免疫學角度分析，腫瘤抗原分為腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原，腫瘤抗原被免疫系統(tǒng)識別，并引發(fā)免疫反應(yīng)，這是腫瘤細胞疫苗發(fā)展的基礎(chǔ)。所謂腫瘤疫苗是即腫瘤抗原或腫瘤相關(guān)抗原的使用，刺激或加強機體的主動免疫，激發(fā)針對腫瘤的特異性免疫反應(yīng)，從而防止或抑制腫瘤的生長、擴散、復(fù)發(fā)。腫瘤疫苗是一種

2、生物治療，與傳統(tǒng)的治療方法（化療，放療，手術(shù)）比較，最大的好處是，沒有明顯的毒副作用，能特異性殺傷腫瘤，特別是在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有無可比擬的潛力。
　　粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種擁有多重功效的細胞因子，不僅能夠刺激粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的增殖、分化，而且還具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，尤其是在增強機體抗腫瘤免疫方面。是目前研究和臨床上抗腫瘤免疫治療中較為重要的細胞因子之一。腫瘤壞死因子α(TNFα)是當前抗癌

3、活性最強的細胞因子，它的抗癌機制是多方面的，主要體現(xiàn)在影響腫瘤細胞凋亡，影響腫瘤血管生成和誘導(dǎo)機體主動免疫三方面。將兩個有免疫協(xié)同效應(yīng)的細胞因子(GM-CSF和TNFα)共同錨定在前列腺癌細胞株P(guān)C-3表面，這樣可以激活免疫活性細胞，增強腫瘤的免疫原性，從而可以誘導(dǎo)人體主動抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生，與GM-CSF和TNFα單獨錨定修飾相比，可以取得更好的療效。
　　本課題關(guān)鍵是，人前列腺癌模型和人外周血淋巴細胞-重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠嵌

4、合體模型(hu-PBL-NOD/SCID)的建立，并用該模型來鑒定GM-CSF/TNFα雙重膜表面修飾的PC-3前列腺癌治療性疫苗的療效。本課題的研制成功，將使新式腫瘤細胞疫苗，即細胞膜表面錨定修飾疫苗，更具國際競爭力，同時可以作為新式膜表面修飾腫瘤細胞疫苗的范例，造就大量針對各類腫瘤的新式膜表面修飾的腫瘤細胞疫苗，形成擁有知識產(chǎn)權(quán)的腫瘤疫苗產(chǎn)業(yè)群。
　　目的:
　　1通過SDS-PAGE對SA-hGM-CSF和SA-TNF

5、α重組雙功能融合蛋白進行鑒定。
　　2通過流式細胞術(shù)檢測SA-hGM-CSF和SA-TNFα確證共同錨定在酒精固定的、已生物素化的PC-3前列腺癌細胞株表面及檢測其錨定率。
　　3完成PC-3前列腺癌表面的SA-hGM-CSF和SA-TNFα生物活性測定，即疫苗活性測定。
　　4 hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型的建立及其鑒定和皮下前列腺癌模型的建立。
　　5在荷瘤hu-PBL-NOD/SCID小鼠，完成S

6、A-hGM-CSF/SA-TNFα膜表面修飾的前列腺癌治療性疫苗有效性的檢測。
　　方法:
　　實驗中，事先將PC-3前列腺癌細胞30％乙醇固定、生物素化修飾，將帶SA的hGM-CSF和TNFα雙功能融合蛋白，錨定在PC-3前列腺癌細胞表面，制備成SA-hGM-CSF/SA-TNFα雙重膜修飾的前列腺癌治療性疫苗，然后，建立前列腺癌皮下模型和人外周血淋巴細胞重度聯(lián)合免疫缺陷鼠嵌合體模型（hu-PBL-NOD/SCID模型），

7、并用該模型來檢測疫苗的有效性。首先建立hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型，然后將PC-3前列腺癌細胞（5×105個/mice）肋脅部皮下植入hu-PBL-NOD/SCID小鼠，根據(jù)事先分組，在植入后第0，7，14天分別用SA-hGM-CSF/SA-hTNFα雙重錨定PC-3疫苗、SA-hGM-CSF單錨定PC-3疫苗、SA-hTNFα單錨定PC-3疫苗、Fixed PC-3、PBS，(i.p.)，治療荷瘤hu-PBL-NOD/SCI

8、D小鼠，觀察腫瘤生長情況、小鼠的存活期以及通過免疫組織化學檢測腫瘤組織，脾臟、肝臟內(nèi)CD4+、CD8+T淋巴細胞浸潤情況。
　　結(jié)果:
　　1純化、復(fù)性的SA-hGM-CSF和SA-TNFα重組融合蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE電泳，在相應(yīng)分子量處，可以清楚的看到條帶，可以形成有活性形式的多聚體。
　　2流式細胞儀分析鏈霉親和素標記(SA)、有生物活性的hGMCSF和/或hTNFα可以有效地錨定在酒精固定，生物素化的PC-

9、3前列腺癌細胞膜表面，而且錨定修飾率達到97％以上。
　　3通過CCK-8試劑測定錨定在酒精固定的、生物素化的PC-3前列腺癌細胞表面的SA-hGM-CSF和SA-hTNFα仍然具有生物活性。
　　4 NOD/SCID小鼠移植人外周血單個核細胞4周后，通過流式細胞分析儀，在小鼠脾臟及外周血中可以檢測到人CD4、CD8、CD45的存在。
　　5 PC-3前列腺癌細胞皮下植入后第60天，SA-hGM-CSF/SA-TNFα

10、雙重錨定治療組有5只小鼠存活(5/5)，其中1只體外無腫瘤觸及;SA-hGM-CSF單錨定治療組有4只小鼠存活(4/5);SA-hTNFα單錨定治療組有3只小鼠存活(3/5);Fixed PC-3有1只小鼠存活(1/5);PBS治療組全部死亡(0/5)。
　　結(jié)論:
　　對于荷瘤hu-PBL-NOD/SCID小鼠，GM-CSF/TNFα雙重錨定治療組與SA-hGM-CSF單錨定組(P＜0.05)和SA-TNFα單錨定組(P＜