慢病毒轉(zhuǎn)GGCX基因?qū)ν霉切躁P(guān)節(jié)炎軟骨細胞的生物學(xué)影響.pdf

1、研究目的：
　　通過檢測慢病毒介導(dǎo)的γ-谷氨酰基羧化酶（ Vitamin K dependent gamma-glutamyl carboxylase，GGCX）基因轉(zhuǎn)染兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞后對其凋亡的影響，以及對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨細胞中MMP13、Ⅱ型膠原和Ⅹ型膠原的影響，探討其對兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的作用。進而為體外骨性關(guān)節(jié)炎的基因治療提供實驗依據(jù)。
　　研究方法：
　　1、選取12只重量約(2.0±0.2)

2、kg左右的日本雄性大耳兔，運用膝前交叉韌帶切斷的方法構(gòu)建動物模型。對白兔進行6周飼養(yǎng)后處死，對兔膝關(guān)節(jié)的軟骨細胞進行分離以及培養(yǎng)，最后運用Alcian Blue染色法以及Ⅱ型膠原纖維染色法對軟骨細胞做鑒定。
　　2、隨機將軟骨細胞分為三個組：空白對照組（不作任何處理）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染不含 GGCX慢病毒的空載體）、轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染含 GGCX慢病毒）。檢測轉(zhuǎn)染成功后分別用qRT-PCR法及Western blot法檢測各組中軟骨細胞

3、中GGCX、MMP13、Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原mRNA及蛋白表達水平。
　　3、運用Annexin V-FITC&PI法來檢測各個分組中軟骨細胞的凋亡的情況。
　　4、運用茜素紅染色軟骨細胞進行組織學(xué)檢查。
　　研究結(jié)果：
　　1、兔骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細胞在初代中顯現(xiàn)為扁平，多角不規(guī)則，有幾個隆突，胞核為橢圓形，位于胞體中間。Alcian Blue染色軟骨細胞表現(xiàn)天藍色，Ⅱ型膠原纖維染色發(fā)現(xiàn)軟骨細胞和胞外基質(zhì)表現(xiàn)棕色或黃

4、色。
　　2、qRT-PCR檢測結(jié)果示：GGCX在轉(zhuǎn)染組中表達水平明顯升高，MMP13在轉(zhuǎn)染組中的表達水平明顯降低，Ⅱ型膠原在轉(zhuǎn)染組中表達明顯升高，X型膠原在轉(zhuǎn)染組中表達水平亦明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），陰性對照組以及空白對照組之間相比較未見顯著差異（P＞0.05）；W-B檢測結(jié)果顯示：GGCX在轉(zhuǎn)染組中表達水平明顯升高，MMP13在轉(zhuǎn)染組中的表達水平明顯降低，Ⅱ型膠原在轉(zhuǎn)染組中表達水平明顯升高，X型膠原在轉(zhuǎn)染組中

5、表達水平亦明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），陰性對照組以及空白對照組之間相比較未見明顯的差異（P＞0.05）。
　　3、運用Annexin V-FITC&PI法檢測各個分組凋亡率的結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組總凋亡率為(17.833±2.612)％，與空白對照組總凋亡率（25.467±2.623）%以及陰性對照組總凋亡率（26.167±2.637）%相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（ P＜0.05），陰性對照組以及空白對照組相比較未

6、見明顯差異存在（ P＞0.05）。
　　4、茜素紅染色結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組中軟骨基質(zhì)深染，細胞數(shù)量多，可見少量鈣結(jié)節(jié)，空白組和陰性對照組中軟骨基質(zhì)染色均一，大量鈣結(jié)節(jié)形成。
　　結(jié)論：
　　1、采取前叉韌帶切斷大白兔的韌帶能夠成功造出白兔骨關(guān)節(jié)炎的模型，并能夠成功分離培養(yǎng)出兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨細胞；
　　2、慢病毒能成功介導(dǎo)GGCX基因轉(zhuǎn)染兔骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞使其表達顯著增加；
　　3、轉(zhuǎn)染含GGCX慢病毒能夠