癌基因Ras及其常見突變與p53協(xié)同作用對結(jié)腸癌細胞化療藥物敏感性的研究.pdf

1、目的：Ras是一種原癌基因，其突變廣泛存在于多種腫瘤細胞中，在結(jié)直腸癌中突變率可達30％以上，與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展以及靶向治療療效預測等均有密切關系。突變后的Ras結(jié)構(gòu)發(fā)生改變引起下游多條信號通路激活，并且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關。p53基因是發(fā)現(xiàn)最早的一種腫瘤抑制基因，參與細胞周期、凋亡、衰老、維持基因組穩(wěn)定性、修復損傷DNA。近年來，p53作為基因治療的靶標已初步應用于臨床，通過對p53基因表達水平的提升以及p53正常功能的修復參

2、與腫瘤的治療。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生過程中p53與Ras介導的通路之間存在著復雜的相互協(xié)同作用關系。因此，在Ras高水平突變的結(jié)直腸癌藥物治療過程中，p53與Ras基因的突變之間存在著怎樣的相互作用關系需要通過體內(nèi)、體外的科學實驗進行深入的研究。本課題旨在利用體外結(jié)腸癌細胞模型，探討p53與Ras及常見突變協(xié)同作用對結(jié)腸癌細胞奧沙利鉑藥物敏感性的影響。為在Ras高突變率的情況下，研究提高化療藥物療效以及開發(fā)新的輔助治療手段提供可靠的實驗依

3、據(jù)。
　　方法：第一部分：收集67對結(jié)直腸癌患者癌組織和癌旁組織，提取mRNA，RT-PCR擴增K-Ras和p53序列，檢測K-Ras和p53突變情況；應用卡方檢驗分析癌組織和癌旁組織突變的差異，應用秩相關性分析K-Ras突變與p53突變的關系。第二部分：體外培養(yǎng)HCT116 p53-/-細胞系，分6組：①Ras單轉(zhuǎn)染組；②RasV12單轉(zhuǎn)染組；③RasN17單轉(zhuǎn)染組；④Ras+Ad-p53組；⑤RasV12+Ad-p53組；⑥R

4、asN17+Ad-p53組；培養(yǎng)HCT116 p53-/-細胞系密度達60%后，經(jīng)過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及病毒感染24小時，奧沙利鉑處理12小時。利用Calcein/PI熒光原位分析不同處理對細胞凋亡水平的影響；應用MTT法檢測奧沙利鉑作用下細胞存活率；提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后實時定量PCR分析凋亡相關基因Bax和Bcl-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；提取細胞總蛋白，通過WB法檢測奧沙利鉑作用下各組中Bax、Bcl-2、p53和Ras等基因相關蛋白表達情

5、況。
　　結(jié)果：1.收集67對結(jié)直腸癌患者的癌組織和癌旁組織，提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄后擴增K-Ras和p53基因，測序檢測突變情況發(fā)現(xiàn)：K-Ras第12個氨基酸突變率最高，在癌組織中達到25.37%（17/67），癌旁組織中突變顯著低于癌組織為14.9%（10/67）（p<0.01）；第13個氨基酸突變率也較高，癌組織和癌旁組織中分別為10.45%（7/67）和2.99%(2/67)（p<0.01）；第17個氨基酸突變率最低，僅有1

6、個患者癌組織和癌旁組織發(fā)生第17位氨基酸的突變（p>0.05）；p53基因的236位點突變率在癌組織中為10.45%（7/67），癌旁組織中為5.97%（4/67）（p<0.05）；249位點突變率在癌組織中為20.9%（14/67），癌旁組織中為11.94%（8/67）（p<0.05）；應用秩相關性分析K-Ras突變與p53突變之間無顯著相關性。2.通過Calcein-AM/PI染色我們發(fā)現(xiàn)，當p53缺失時，Ras單轉(zhuǎn)染組、RasV1

7、2單轉(zhuǎn)染組、RasN17單轉(zhuǎn)染組的凋亡率分別為（8.3±1.5）%、(16.8±1.7)%、(4.4±1.6)%，其中RasV12單轉(zhuǎn)染組凋亡率明顯高于其他兩組，這提示我們在L-OHP藥物作用下，RasV12突變顯著提高了細胞凋亡率；當p53高表達時，Ras+Ad-p53、RasV12+Ad-p53、RasN17+Ad-p53凋亡率分別為(13.5±1.9)%、(25.9±2.2)%、(7.6±1.2)%，RasV12+Ad-p53組凋

8、亡率最高，而對比于p53缺失的三組，p53高表達的三組凋亡率明顯增高，這說明L-OHP藥物作用下Ras與p53具有協(xié)同增強細胞的凋亡的作用。3.為了證實Calcein-AM/PI染色結(jié)果，我們又應用了MTT法檢測奧沙利鉑作用下各種細胞的存活數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， RasN17轉(zhuǎn)染組、Ras轉(zhuǎn)染組、RasV12轉(zhuǎn)染組、RasN17+p53組、Ras+p53組、RasV12+p53組六組的平均OD值分別為0.875、0.769、0.647、0.4

9、82、0.316、0.247，細胞相對存活率分別為93.3%，82.0%，69.0%，51.4%，33.7%，26.3%。4.隨后我們通過免疫印記結(jié)果來進一步證實，Ras+Ad-p53、RasV12+Ad-p53、RasN17+Ad-p53三組的凋亡蛋白Bax表達水平均高于Ras單轉(zhuǎn)染組、RasV12單轉(zhuǎn)染組、RasN17單轉(zhuǎn)染組，驗證了Ras與p53具有協(xié)同增強細胞凋亡的作用， Bcl-2的表達水平則與Bax結(jié)果相反；而在Ras+Ad

10、-p53、RasV12+Ad-p53、RasN17+Ad-p53三組中， RasV12+Ad-p53組的Bax表達水平最高，Ras+Ad-p53組次之，RasN17+Ad-p53最低， Bcl-2的表達水平則與Bax結(jié)果相反。5.最后，我們通過實時熒光定量PCR來表明， p53高表達與缺失條件下，RasV12轉(zhuǎn)染組Bax mRNA表達水平均顯著高于Ras轉(zhuǎn)染組和RasN17轉(zhuǎn)染組，且p53高表達時較p53缺失時表達水平明顯增高。