產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶銅綠假單胞菌的流行及耐藥分子機(jī)制分析.pdf

1、研究背景：
　　銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌，也是全球非常重要的醫(yī)院感染病原菌，據(jù)統(tǒng)計(jì)，人類感染的非發(fā)酵菌中，60％為銅綠假單胞菌感染。近年來，銅綠假單胞菌感染的持續(xù)高發(fā)，耐藥情況的日趨嚴(yán)峻，部分抗生素耐藥率的逐年上升，以及多重耐藥和泛耐藥的日益常見，均給臨床治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。有關(guān)銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的研究成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)，同時(shí)，因其耐藥機(jī)制極其復(fù)雜，也成為當(dāng)今研究的難點(diǎn)。
　　超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)

2、是β-內(nèi)酰胺酶中的一種，是一類可水解氧亞胺基β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶，能導(dǎo)致對(duì)第三代頭孢菌素如頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松和單環(huán)類抗生素如氨曲南，甚至第四代頭孢菌素如頭孢吡肟和頭孢匹羅的耐藥。ESBLs在銅綠假單胞菌中的檢出率越來越高，已經(jīng)成為銅綠假單胞菌β-內(nèi)酰胺類抗生素臨床治療效果下降的最主要原因之一。但是，一直以來銅綠假單胞菌的ESBLs檢測(cè)存在爭(zhēng)議，尚無標(biāo)準(zhǔn)、高效的檢測(cè)方法，有關(guān)銅綠假單胞菌ESBLs攜帶情況、基因型別、

3、流行情況等等尚缺乏詳盡的數(shù)據(jù)。
　　隨著分子生物學(xué)技術(shù)、信息技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。高通量測(cè)序技術(shù)，又稱為下一代測(cè)序技術(shù)，以能一次并行對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長(zhǎng)較短為特點(diǎn)。高通量測(cè)序技術(shù)使人類獲取基因組信息的方式發(fā)生了重大的變革，尤其適用于基因組較小的微生物領(lǐng)域的研究，已成為微生物鑒定分型、毒力分析、傳播途徑、耐藥機(jī)制等方面研究的重要工具。
　　本研究采用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的ESBL

4、s表型確證試驗(yàn)，對(duì)本院可疑ESBLs陽性銅綠假單胞菌進(jìn)行篩選，以多重 PCR方法對(duì)篩選陽性的結(jié)果進(jìn)行耐藥基因的檢測(cè)，以了解我院銅綠假單胞菌ESBLs流行情況，并探討銅綠假單胞菌的ESBLs不同檢測(cè)方法間的優(yōu)劣；然后，通過高通量測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)其中一株多重耐藥菌株的全基因組測(cè)序，通過生物信息學(xué)分析，展開對(duì)銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制、耐藥基因環(huán)境等的研究。
　　研究目的：
　　了解廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離的銅綠假單胞菌的耐藥性

5、及其超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的流行分布情況，深入分析銅綠假單胞菌的耐藥基因環(huán)境，探討其耐藥的分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1、收集2011年1月至2012年6月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院微生物室分離出的銅綠假單胞菌，所有菌株用VITEK2微生物全自動(dòng)鑒定儀進(jìn)行鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)，篩選頭孢他啶耐藥（MIC≥16ug/ml）的銅綠假單胞菌株，即可疑產(chǎn)ESBLs菌株，并對(duì)患者特點(diǎn)、病區(qū)分布、標(biāo)本類型、藥敏結(jié)果等資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分

6、析其流行病學(xué)特點(diǎn)。
　　2、采用表型確證試驗(yàn)篩選產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的菌株，并對(duì)表型試驗(yàn)陽性菌株和表型試驗(yàn)陰性菌株的耐藥率、多重耐藥、泛耐藥等情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較。
　　3、采用多重 PCR技術(shù)對(duì)表型試驗(yàn)陽性菌株進(jìn)行相關(guān)耐藥基因檢測(cè)，了解本院銅綠假單胞菌 ESBLs的主要基因型別，并探討銅綠假單胞菌 ESBLs不同檢測(cè)方法的優(yōu)劣。
　　4、用細(xì)菌 DNA純化試劑盒提取多重耐藥菌株 PA902的總 DNA，并用Illu

7、mina Miseq高通量測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。用Edena軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接，RAST網(wǎng)上工具進(jìn)行基因注釋，ResFinder和NCBI BLAST網(wǎng)上工具進(jìn)行耐藥基因分析， NCBI BLAST網(wǎng)上工具進(jìn)行耐藥基因遺傳環(huán)境分析，PlasmidFinder網(wǎng)上工具進(jìn)行質(zhì)粒序列分析，MLST網(wǎng)上工具進(jìn)行MLST分析。
　　研究結(jié)果：
　　1、111株頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌的流行病學(xué)分析和藥敏結(jié)果分析2011年1月至2012年6月

8、廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院微生物室共分離出111株頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌。這些菌株分別來自于痰液63.9%（71/111）、胸水7.2%（8/111）、傷口分泌物7.2%（8/111）、尿液5.4%（6/111）、腹水4.5%（5/111）、血液3.6%（4/111）、其它標(biāo)本類型5.4%（6/111）?；颊吣挲g分布為：≥80歲20.7%（23/111）、70-79歲26.1%（29/111）、60-69歲13.5%（15/111）、

9、50-59歲18.9%（21/111）、其它年齡20.7%（23/111）?；颊卟^(qū)分布為：重癥醫(yī)學(xué)科37.8%（42/111）、內(nèi)科綜合病區(qū)11.7%（13/111）、胸外科病區(qū)9.9%（11/111）、呼吸內(nèi)科病區(qū)9.9%（11/111）、其它外科病區(qū)15.3%（17/111）、其它內(nèi)科病區(qū)9.0%（10/111）、兒科0.9%（1/111）、外院5.4%（6/111）。111株頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌對(duì)11種抗生素的不敏感率如下

10、：哌拉西林94.4%、哌拉西林-他唑巴坦90.8%、頭孢吡肟81.1%、氨曲南91.9%、美羅培南72.7%、亞胺培南73%、慶大霉素55.9%、妥布霉素41.4%、阿米卡星31.5%、環(huán)丙沙星73%、左旋氧氟沙星66.7%。
　　2、ESBLs表型確證試驗(yàn)結(jié)果分析111株頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶表型確證試驗(yàn)陽性菌株共23株，陽性率為20.7％；23株表型試驗(yàn)陽性菌株的藥敏結(jié)果顯示除阿米卡星外，對(duì)其它10種抗

11、生素均呈現(xiàn)很高的耐藥率；經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件的 X2檢驗(yàn)，23株產(chǎn)酶株對(duì)頭孢吡肟、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星幾種藥物的耐藥率顯著高于88株非產(chǎn)酶株的耐藥率，對(duì)哌拉西林、氨曲南、美羅培蘭、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南耐藥率均較高，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；產(chǎn)酶株與非產(chǎn)酶株的多重耐藥、泛耐藥菌株比率經(jīng)X2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示產(chǎn)酶株的泛耐藥菌株和全耐藥菌株比率顯著高于非產(chǎn)酶株。
　　3、多重PCR檢測(cè)ESBLs基因結(jié)果分析

12、用多重PCR對(duì)23株表型試驗(yàn)陽性菌株進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)20株ESBLs基因檢測(cè)陽性，其中19株為PER型，5株為TEM型，4株同時(shí)攜帶PER型和TEM型耐藥基因，未檢測(cè)出其它型別的ESBLs耐藥基因。
　　4、選取了一株多重耐藥銅綠假單胞菌PA902，PCR法證實(shí)該菌株攜帶PER型ESBLs基因，對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序，共得到5,061,082條reads，預(yù)測(cè)基因組覆蓋深度為198倍。通過數(shù)據(jù)過濾和拼接，共獲得2693條contigs，

13、最長(zhǎng)contig長(zhǎng)為60,157 bp，N50為19,105 bp，平均contig長(zhǎng)度為2915 bp，GC含量為62.5%。
　　5、對(duì)拼接后的數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，編碼β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因有3個(gè)，包括blaOXA-10, blaPER-1和blaVIM-2，氨基糖苷類耐藥基因發(fā)現(xiàn)了4個(gè)，分別為aph(3')-IId, aac(6')-Ib-cr, aacA4和aadA2，磺胺類耐藥基因有1個(gè)，為sul1，四環(huán)素耐藥基因有1個(gè)，為t

14、etG；氯霉素耐藥基因有1個(gè)，為floR。對(duì)染色體上的耐藥基因研究發(fā)現(xiàn)，染色體攜帶突變的gyrA和parC基因，與喹諾酮耐藥密切相關(guān)，另外還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與藥物外排相關(guān)的耐藥基因。
　　6、對(duì)攜帶耐藥基因的 contigs進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn) C401、C599、C651、C769和C1379等5個(gè)contigs攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥基因，并在這些contigs上面發(fā)現(xiàn)了1類和2類整合子的結(jié)構(gòu)；對(duì)質(zhì)粒序列的研究發(fā)現(xiàn)，基因組數(shù)據(jù)中存在一個(gè)可能與質(zhì)粒

15、復(fù)制相關(guān)的基因，11個(gè)與接合相關(guān)的基因，可能與多個(gè)耐藥基因的轉(zhuǎn)移有關(guān)。MLST研究發(fā)現(xiàn)該菌株屬于 ST389，為首次發(fā)現(xiàn)攜帶 blaVIM-2和blaPER-1的ST389銅綠假單胞菌。
　　結(jié)論：
　　1、我院頭孢他啶耐藥銅綠假單胞菌感染以引起中老年、危重患者的呼吸道感染為主，對(duì)頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌，對(duì)常用多種抗生素耐藥率高，多重耐藥和泛耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。
　　2、表型確證實(shí)驗(yàn)檢測(cè)我院頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌，產(chǎn)

16、ESBLs菌株檢出率為20.7%；產(chǎn)酶株和非產(chǎn)酶株對(duì)哌拉西林、氨曲南、美羅培蘭、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南耐藥率均較高，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；產(chǎn)酶株對(duì)頭孢吡肟、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星的耐藥率顯著高于非產(chǎn)酶株，且產(chǎn)酶株的泛耐藥菌株和全耐藥菌株比率顯著高于非產(chǎn)酶株。
　　3、我院2011年至2012年6月臨床分離的頭孢他啶耐藥銅綠假單胞菌產(chǎn)ESBLs以PER型最常見。
　　4、高通量測(cè)序可快速、全面、準(zhǔn)確